Диагностическое значение определения мочевины в сыворотке крови. Определение мочевины в сыворотке крови по цветной реакции с диацетилмонооксимом

Мочевина – основной продукт распада белков. Она является той химической формой, в которой ненужный организму азот удаляется с мочой.

Накопление мочевины и других азотсодержащих соединений в крови вследствие почечной недостаточности приводит к уремии.

Синонимы русские

Диамид угольной кислоты, карбамид, мочевина в крови.

Синонимы английские

Urea nitrogen, Urea, Blood Urea Nitrogen (BUN), Urea, Plasma Urea.

Метод исследования

УФ кинетический тест.

Единицы измерения

Ммоль/л (миллимоль на литр).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Венозную, капиллярную кровь.

Как правильно подготовиться к исследованию?

• Не принимать пищу в течение 12 часов до исследования.
• Исключить физическое и эмоциональное перенапряжение и не курить 30 минут до сдачи крови.

Общая информация об исследовании

Мочевина – один из конечных продуктов белкового метаболизма, содержащий азот. Она продуцируется в печени, переносится кровью в почки, там фильтруется через сосудистый клубочек, а затем выделяется. Результат теста на мочевину является показателем клубочковой продукции и экскреции мочи.

Метаболизированный азот находится в организме в виде аммиака, производимого из остатков распада и переработки белков. Аммиак в печени, соединяясь с углекислым газом, образует мочевину. Быстрое разрушение белков и повреждение почек стремительно поднимают уровень мочевины в крови (так же как и практически любая массивная гибель клеток).

Количество выделяемой мочевины находится в прямой зависимости от уровня потребляемого человеком белка, оно повышается при лихорадочных состояниях, при осложнениях диабета и при усиленной гормональной функции надпочечников. Повышенный уровень мочевины – маркер снижения клубочковой фильтрации.

Мочевина – один из основных метаболитов крови, организм никак её не использует, а только избавляется от неё. Так как этот процесс выделения непрерывный, определенное количество мочевины всегда находится в крови.

Уровень мочевины следует трактовать неотрывно от показателей креатинина. Термин «уремия» применяется, когда концентрация мочевины в крови поднимается выше 20 ммоль/л.

Азотемия, показателем которой также служит повышение концентрации мочевины, чаще всего является следствием неадекватной экскреции из-за заболеваний почек.

Уровень мочевины в крови снижается при многих заболеваниях печени. Это происходит из-за неспособности повреждённых клеток печени синтезировать мочевину, что, в свою очередь, ведет к повышению концентрации аммиака в крови и развитию печёночной энцефалопатии.

Почечная недостаточность проявляется при утрате клубочка способности фильтровать через себя метаболиты крови. Это может произойти внезапно (острая почечная недостаточность) в ответ на заболевание, введение лекарств, ядов, повреждение. Иногда это следствие хронических заболеваний почек (пиелонефрита, гломерулонефрита, амилоидоза, опухоли почек и др.) и других органов (диабета, гипертонической болезни и др.).

Анализ на мочевину обычно назначают в комбинации с тестом на креатинин.

Для чего используется исследование?

• Для оценки функции почек при целом ряде состояний (вместе с тестом на креатинин).
• Для диагностики заболевания почек и для проверки состояния пациентов с хронической или острой почечной недостаточностью.

Когда назначается исследование?

• Мочевина проверяется во время биохимического исследования:
  • при неспецифических жалобах,
  • при оценке функции почек перед назначением лекарственной терапии,
  • перед госпитализацией пациента из-за острого заболевания,
  • при нахождении человека в стационаре.
• При симптомах нарушения функции почек:
  • слабость, утомляемость, снижение внимания, плохой аппетит, проблемы со сном,
  • отёки на лице, запястьях, лодыжках, асцит,
  • пенистая, красного или кофейного цвета моча,
  • снижение диуреза,
  • проблемы с актом мочеиспускания (жжение, прерывистость, преобладание ночного диуреза,
  • боль в поясничной области (особенно по бокам от позвоночника), под рёбрами,
  • высокое давление.
• К тому же данный анализ может проводиться периодически:
  • для проверки состояния больных хроническими заболеваниями почек или при таких непочечных хронических заболеваниях, как диабет, застойная сердечная недостаточность, инфаркт миокарда, артериальная гипертензия и др.,
  • перед лекарственной терапией и во время неё, чтобы определить состояние функции почек,
  • после сеансов диализа для оценки их эффективности.

Что означают результаты?

Референсные значения

Возраст, пол		Референсные значения
		1,8 — 6 ммоль/л
		2,5 — 6 ммоль/л
		2,9 — 7,5 ммоль/л
20 — 50 лет		3,2 — 7,3 ммоль/л
		2,6 — 6,7 ммоль/л
		3 — 9,2 ммоль/л
		3,5 — 7,2 ммоль/л

Причины повышения уровня мочевины:

• снижение функции почек, вызванное застойной сердечной недостаточностью, потерей солей и жидкости, шоком в сочетании с чрезмерным катаболизмом белка (желудочно-кишечное кровотечение, острый инфаркт миокарда, стресс, ожоги),
• хроническое заболевание почек (пиелонефрит, гломерулонефрит, амилоидоз, туберкулёз почек и др.),
• обструкция мочевыводящих путей (опухоль мочевого пузыря, аденома простаты, мочекаменная болезнь и др.),
• кровотечение из верхних отделов ЖКТ (язвенная болезнь желудка, двенадцатиперстной кишки, рак желудка, двенадцатиперстной кишки и др.),
• сахарный диабет с кетоацидозом,
• повышенный катаболизм белка при онкологических заболеваниях,
• приём кортикостероидов, нефротоксичных лекарственных препаратов, тетрациклинов, избыток тироксина,
• применение анаболических стероидов,
• питание с высоким содержанием белков (мяса, рыбы, яиц, сыра, творога).

Причины понижения уровня мочевины:

• печёночная недостаточность, некоторые заболевания печени: гепатит, цирроз, острая гепатодистрофия, опухоли печени, печёночная кома, отравления гепатотоксичными ядами, передозировки лекарственных средств (при этом нарушается синтез мочевины),
• акромегалия (гормональное заболевание, характеризующееся повышенной выработкой соматотропного гормона),
• голодание, низкобелковая диета,
• нарушение кишечного всасывания (мальабсорбция), например, при целиакии,
• нефротический синдром (повышенное выделение белка с мочой, гиперлипидемия, снижение уровня белка в крови),
• повышенная выработка антидиуретического гормона (АДГ) и, как следствие, патологическая гиперволемия,
• беременность (повышен­ный синтез белка и увеличение почечной фильтрации вызывают сни­жение количества мочевины у беременных женщин).

Что может влиять на результат?

Принцип метода основан на определении количества аммиака, высвобождаемющегося при разложении мочевины сыворотки или цельной крови под действием уреазы, колориметрическим методом с использование метода Несслера.

Диагностическое значение имеет повышение концентрации мочевины, которое встречается при хронических поражениях почек, усиленном распаде белков в тканях, непроходимости кишечника, закупорке мочевыводящих путей. Снижение уровня мочевины встречается при голодании, безбелковой диете, ферментных дефектах мочевинообразования.

Креатин и креатинин. Количественное определение креатинина, роль,

Диагностическое значение.

Креатин - азотсодержащая карбоновая кислота, которая встречается в организме позвоночных. Участвует в энергетическом обмене в мышечных и нервных клетках.

Креатини́н - конечный продукт креатин-фосфатной реакции. Креатинин образуется в мышцах и затем выделяется в кровь. Креатинин участвует в энергетическом обмене мышечной и других тканей. Из организма креатинин выводится почками с мочой, поэтому креатинин (его количество в крови) - важный показатель деятельности почек.

Принцип метода основан на способности креатинина реагировать в щелочной среде с пириновой кислотой с образованием окрашенных в оранжевый цвет продуктов. Интенсивность развивающегося окрашивания пропорциональна количеству креатинина.

Диагностическое значение: содержание креатинина в сыворотке крови резко возрастает при почечной недостаточности, застойной сердечной недостаточности, акромегалии, при избытке в пище белков животного происхождения.

39. Программированный контроль–3: знать формулы: ФАФС, УДФГК

(развернутые); химизм реакций обезвреживания аммиака в месте

образования, синтеза мочевины и креатинина, химизм образования

аммонийных солей, транспортных форм аммиака, обезвреживания

биогенных аминов.

ФАФС УНД УДФГК .

Механизмы обезвреживания на месте.

Синтез мочевины.

Синтези креатина .

Креатинина :

Реактивы . Цветной реактив*; мочевина, стандартный раствор 1 г/л, или 16,65 ммоль/л; набор «Уреатест».

Оборудование . Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1, 2 и 5 мл; алюминиевая фольга; водяная баня; ФЭК.

Материал .

Сыворотка крови.

Моча, собранная за сутки, профильтрованная и разведенная перед анализом водой в 25 раз.

а. Определение содержания мочевины в сыворотке крови. Метод основан на способности мочевины в присутствии тиосемикарбазида и солей железа в сильнокислой среде образовывать с диацетилмонооксимом соединение красного цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию мочевины в исследуемой жидкости.

Ход определения . В опытную пробирку отмеривают 0,1 мл разведенной в 10 раз сыворотки крови, в стандартную – такой же объем стандартного раствора мочевины и в контрольную – 0,1 мл дистиллированной воды. Добавляют во все пробирки по 2 мл цветного реактива и тщательно перемешивают их содержимое встряхиванием.

Все пробирки закрывают крышечкой из алюминиевой фольги и нагревают в кипящей водяной бане в течение 10 мин (точно! ). Затем охлаждают их под струей холодной воды.

Измеряют экстинкцию стандартной и опытной проб против контрольной на ФЭКе при 540-560 нм (светофильтр зеленый) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Примечание . Окраска неустойчива, поэтому измерение необходимо провести в течение 15 мин.

Расчет . Содержание мочевины х (ммоль/л) в сыворотке крови рассчитывают по формуле

Е оп 16,65∙10

где Е оп – экстинкция опытной пробы против контрольной;

Е ст – экстинкция стандартной пробы против контрольной;

16,65 – концентрация мочевины в стандартной пробе, ммоль;

Азот мочевины (в ммоль/л) рассчитывают, разделив полученное значение содержания мочевины в сыворотке на 2,14 (число, выражающее отношение молекулярной массы азота мочевины к массе всей молекулы мочевины).

б. Определение содержания мочевины в моче. Принцип метода тот же, что и в предыдущей работе.

Ход определения . Для анализа используют 0,1 мл разведенной мочи и 0,1 мл стандартного раствора мочевины и обрабатывают эти пробы так же, как и сыворотку крови.

Расчет проводят по формуле

Е оп V25∙1,665

Е ст 0,1∙1000

где х – количество мочевины, ммоль/сут;

V – объем суточной мочи;

Е оп – экстинкция опыта;

Е ст – экстинкция стандарта;

0,1 – объем мочи, взятый на исследование, мл;

1000 – коэффициент пересчета мкмоль в ммоль.

в. Определение содержания мочевины в сыворотке крови экспресс-методом с помощью набора «Уреатест». Метод основан на способности уреазы разлагать мочевину с образованием аммиака, который окрашивает полоску реактивной хроматографической бумаги в голубой цвет. Высота окрашенной зоны пропорциональна концентрации мочевины, которую рассчитывают по калибровочному графику.

Ход определения . Сыворотку крови разводят водой в отношении 1:1. На пропитанный ферментом конец бумажной полоски в 3 мм от красной парафиновой полосы наносят специальной пипеткой 0,03 мл разведенной сыворотки крови. Полоску тотчас помещают в чистую сухую пробирку, герметически закрывают ее пробкой и ставят в термостат при 37˚С. Через 20 минут полоску извлекают, измеряют высоту окрашенной в голубой цвет зоны.

Расчет . По калибровочному графику, входящему в набор «Уреатест», находят концентрацию мочевины в сыворотке крови.

Оформление работы . Сделать расчет содержания мочевины и азота мочевины в исследуемой сыворотке и моче. В выводе отметить возможные изменения в азотном обмене.

Практическое значение работы . В норме содержание мочевины в сыворотке крови человека составляет 3,0-7,0 ммоль/л, а азота мочевины – 1,2-3,7 ммоль/л. Содержание мочевины в сыворотке крови значительно колеблется в зависимости от приема белков с пищей. Повышение уровня мочевины в крови (азотемия) отмечается при заболеваниях почек (когда нарушена их выделительная функция), при усиленном распаде белков, избыточном белковом питании, а также в случае обезвоживания организма (в данном случае имеет место относительная, а не абсолютная форма азотемии). Снижение уровня мочевины в крови и выделения ее с мочой (в сутки в норме выделяется 333-582,8 ммоль/сут) наблюдается при заболевании печени (паренхиматозная желтуха, дистрофия печени, цирроз), что связано с нарушением мочевинообразовательной функции.

Работа 60. Определение концентрации мочевины в сыворотке крови и моче

С мочой у взрослого человека выделяется за сутки 20-35 г, или 333-583 ммоль мочевины. Мочевина – диамид угольной кислоты, образующийся в печени при обезвреживании аммиака. В норме в сыворотке крови содержится 3,33-8,32 ммоль/л мочевины.

Принцип метода . Мочевина образует с диацетилмонооксимом в присутствии тиосемикарбазида и солей железа в кислой среде окрашенные соединения. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации мочевины в исследуемой моче и сыворотке крови и определяется фотометрически.

Исследуемый материал : сыворотка крови, моча.

Реактивы: стандартный раствор мочевины (16,7 ммоль/л). 5%-ный раствор хлорного железа (основной раствор: 5 г хлорного железа доводят до 100 мл водой, после чего подкисляют 1 мл концентрированной H 2 SO 4 ; рабочий раствор готовят из основного: 1 мл основного раствора доводят до объема 100 мл дистиллированной водой, добавляют 8 мл концентрированной H 2 SO 4 и 1 мл 85%-ной ортофосфорной кислоты; раствор хранят в темной посуде). 2,5%-ный водный раствор диацетилмооксима, 0,25%-ный раствор тиосемикарбазида (хранят в темной посуде). Цветной реактив хлорида (готовят каждый раз перед употреблением): к 30 мл рабочего раствора хлорного железа добавляют 20 мл дистиллированной воды, 1 мл 2,5%-ного диацетилмооксима и 0,25 мл 0,25%-ного тиасемикарбазида).

Оборудование : пипетки, пробирки, ФЭК, кюветы с длиной оптического

пути 5 мм.

ХОД РАБОТЫ . Мочу перед определением развести в 10 раз. В одну пробирку вносят 0,1 мл мочи, в другую – 0,1 мл сыворотки крови, в третью – стандартный раствор мочевины. Затем во все 3 пробирки добавляют по 2 мл рабочего раствора для определения мочевины, перемешивают и ставят на кипящую водяную баню на 10 мин. Затем пробирки охлаждают в струе холодной воды и колориметрируют на зеленом светофильтре в кювете с длиной оптического пути 5 мм против воды.

Расчет производят по формуле:

167Е оп /Е ст (для мочи).

Пониженное содержание мочевины в моче отмечается при нефрите, ацидозе, паренхиматозной желтухе, циррозе печени, уремии, повышенное – при недостатке белка в питании, злокачественной анемии, лихорадке, интенсивном распаде белков в организме, после приемов салицилатов, при отравлении фосфором.

Уреазный метод определения мочевины

Мочевинаявляется основной фракцией остаточного азота, определение которой используется в диагностических целях. Синтез ее происходит в печени из аммиака, который образуется при дезаминировании аминоктислот, распада пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов.

Отклонения от нормального содержания мочевины в сыворотке крови зависит от скорости процессов синтеза мочевины и ее выделения. Увеличение содержания мочевины в сыворотке крови является одним из главных признаков нарушения почек. Из фракций остаточного азота раньше всего повышается уровень мочевины. При почечной недостаточности азот мочевины может составлять до 90% фракций остаточного азота.

Повышение уровня мочевины сыворотки крови может носить и внепеченочный характер: при потере жидкости, при усиленном распаде белков (острая атрофия печени, тяжелые печени) из-за нарушения синтеза мочевины в печени.

Принцип метода: Мочевина под действием уреазы разлагается с образованием аммиака и углекислого газа. Для уреазы мочевина является единственным субстратом, поэтому уреазные методы высокоспецифичны. Выделившийся аммиак образует с гипохлоритом натрия и фенолом окрашенный продукт – индофенол (синего цвета). Интенсивность окраски пропорциональна содержанию мочевины.

Реактивы:

2. Этилендиамин-N (N-тетрауксусной кислоты динатриевая соль).

3 ЭДТА – буфер рН 6,5: 0,6 г трилона В растворяют в 30-40 мл воды, доводят до рН 6,5 раствором едкого натра и доливают водой до 50 мл.

4. Основной раствор уреазы в буфере: 20 мг уреазы растворяют в 10 мл буфера.

5. Рабочий раствор уреазы - перед началом определения берут необходимое количество основного раствора и разводят бидистиллированной водой в отношении 1:4.

7. Натрия нитропруссид 2-водный.

8. Цветной реактив: фенол – 0,11 моль/л, нитропруссид натрия – 0,18 моль/л: 0,0263 г нитропруссида натрия помещают в мерную колбу на 500 мл, приливают примерно 300 мл воды, растворяют при перемешивании. Затем добавляют 5,18 г фенола и доливают водой до метки.

9. Натр едкий 1 моль/л; 0,26 моль/л.

10. Гипохлорид натрия:10 г хлорной извести размешивают в течение 15 минут с 17 мл воды, затем добавляют раствор, состоящий из 17 мл воды и 7 г карбоната натрия. Масса сначала густеет, а затем разжижается. Надосадочную жидкость сливают и фильтруют через промытый водный фильтр. Как только раствор приобретает слабо желтую окраску, добавляют 10 капель 1%-ного раствора крахмала и титруют до обесцвечивания.

11. Основной раствор гипохлорита натрия разводят водой так, чтобы концентрация хлора составляла 0,78 г/л, смешивают с равным объемом 0,26 моль/л раствором едкого натрия (100мл+100мл).

12. Мочевина.

13. Бензойная кислота, 2 г/л (кислоту растворяют при нагревании).

14. Калибровочный раствор мочевины, 0,5 ммоль/л: 15 мг мочевины растворяют в мерной колбе на 500 мл в 2 г/л растворе бензойной кислоты.

Ход определения: Перед определением сыворотку разводят 0,154 моль/л раствором хлорида натрия в отношении 1:9.

Опытная проба: 100 мкл рабочего раствор уреазы вносят в пробирку, добавляют 20 мкл разведенной сыворотки. Закрывают пробкой, перемешивают и инкубируют в течение 15 минут при 37 °С. После инкубации добавляют 300 мкл цветного реактива и 300 мкл рабочего раствора гипохлорита натрия. Перемешивают и инкубируют в течение 20-30 минут при 37 °С. Измеряют экстинкцию в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы.

Холостую пробу обрабатывают так же, как опытную, но вместо сыворотки берут 0,154 моль/л раствор.

Калибровочную пробу обрабатывают так же, как опытную, но вместо сыворотки берут калибровочный раствор мочевины. Измеряют при тех же условиях против холостой пробы.

Расчет ведут по формуле:

Количество мочевины, ммоль/л = -------- х 0,5 х 10

Где Е оо - экстинкция опытной пробы, Е к – экстинкция калибровочной пробьы: 0,5 - концентрация мочевины в калибровочном растворе ммоль/л, 10 – коэффициент разведения.

Нормальные величины. Сыворотка крови – 2, 5-8,3 ммоль/л, или 20-50 мг/100мл.

Количественное определение мочевины в сыворотке крови....................................................................................Стр10

Лабораторная работа №15

Количественное определение витамина С в сыворотке крови...................................................................................стр11

Лабораторная работа №16

Определение содержания витамина с в моче.................................................................................................................Стр11

Лабораторная работа №17

Коагуляционная проба Вельтмана.....................................................................................................................................стр12

Лабораторная работа №18

Определение общего гемоглобина методом щелочной денатурации..........................................................................стр12

Лабораторная работа №19

Определение билирубина методом Иедрашека..............................................................................................................стр13

Лабораторная работа №20

Определение кальция, фосфора в сыворотке крови титрометрическим методом

с применением мурексида...................................................................................................................................................стр14

Лабораторная работа №21

Качественные реакции на неорганические и органические составные части мочи...............................................стр14

Лабораторная работа №22

Определение белка слюны биуретовым методом.........................................................................................................стр15

Лабораторная работа № 1

Количественное определение активности амилазы слюны........................................................................................стр16

Лабораторная работа №2

Определение активности щелочной фосфатазы слюны...............................................................................................стр16

Лабораторная работа №3

Определение трансаминазной активности слюны......................................................................................................стр17

Лабораторная работа №4

Определение кальция в слюне титрометрическим методом с применением мурексида...................................стр18

Правила работы на кфк-2

1.Калориметр включить в сеть за 15 мин. до начала измерений. Во время прогрева кюветное отделение должно быть открыто (при этом шторка перед фотоприемниками перекрывает световой пучек).

2. Установить необходимый светофильтр. При переключении светофильтров ручка «чувствительность» должна находится в положении «1» (красный светофильтр 670- «1», зеленый светофильтр 540- «1»), а ручка «установка 100 Грубо» в крайнем левом положении (это предохраняет прибор от перегрузки и порчи).

3. В световой поток поместить кювету с контрольным раствором по отношению к которому производят измерения.

4. Во вторую ячейку кюветодержателя поместить кювету с исследуемым раствором.

5. Закрыть крышку кюветного отделения.

6. Ручка ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ и УСТАНОВКА 100 вначале ГРУБО, затем ТОЧНО установить отсчет 100 по шкале калориметра.

7. Поворотом ручки под кюветным отделением до упора, ввести в световой поток кювету с исследуемым раствором.

8. Снять отсчет по шкале Д в единицах оптической плотности.

Занятие № 30 работа № 1. Определение мочевины в сыворотке крови (диацетилмонооксимный метод)

Мочевина - продукт, образующийся в печени при обезвреживании аммиака. Мочевина - основной конечный продукт обмена белков. Примерно 50 % небелкового, остаточного азота крови приходится на долю мочевины.

ПРИНЦИП МЕТОДА: мочевина образует с диацетилмонооксимом в сильнокислой среде в присутствии тиосемикарбазида и ионов трехвалентного железа комплексное соединение красного цвета, по интенсивности окраски которого определяют ее концентрацию.

ХОД РАБОТЫ: взять три пробирки: опыт, стандарт, контроль.

Все пробирки поместить в водяную баню при температуре 100оС в течение 5 минут.

Охладить и произвести измерение экстинкции против контроля при 500-560 нм; кювета 10 мм. Измерения проводят в пределах 15 минут.

РЕЗУЛЬТАТ:

КОНЕЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ: рассчитывают по формуле:

Х = ----- х 16,65 = ммоль/л

где Х - концентрация мочевины, ммоль/л.

А 1 - экстинкция опытной пробы (Ехо).

А 2 - экстинкция стандартной пробы (Ех ст.).

РАСЧЁТ:

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.

Нормальное содержание мочевины в сыворотке крови у взрослых 2,5 - 8,32 ммоль/л; в моче 333 - 582 ммоль/сут.

Незначительное повышение концентрации мочевины в сыворотке крови наблюдается при избыточном питании белковыми продуктами, при старении.

Значительное увеличение концентрации мочевины в сыворотке крови (уремия) наблюдается при почечной недостаточности, обезвоживании (рвота, понос), шоке, усиленном распаде белков, сепсисе.

Пониженное содержание мочевины в сыворотке крови отмечается при паренхиматозном гепатите, циррозе (резкое снижение мочевинообразовательной функции печени), эклампсии, во время беременности.

Пониженное содержание мочевины в моче отмечается при нефрите, ацидозе, паренхиматозной желтухе, циррозе печени

ВЫВОД:

Дата ________________

Занятие № 31

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ АУДИТОРНАЯ РАБОТА

ПО ТЕМЕ «ОБМЕН И ФУНКЦИИ АМИНОКИСЛОТ. ОБМЕН НУКЛЕОТИДОВ»

Задания для самостоятельной работы:

1.Составить метаболическую карту аминокислотного обмена.

На карте отметить:

2.1. Источники аминокислот в тканях.

2.2. Пути превращения аминокислот в тканях.

2.3. Регуляторные ферменты гликолиза, метаболизма гликогена, глюконеогенеза, пентозофосфатного пути.

2.4. Витаминзависимые ферменты.

Решение и обсуждение ситуационных задач.

Дата: ________________

ЗАНЯТИЕ № 33

РАБОТА № 1. КАЧЕСТВЕННОЕ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИЛИРУБИНА (ПО МЕТОДУ ЙЕНДРАШИКА)

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ. При разрушении эритроцитов (у человека через 100-120 дней) в клетках ретикулоэндотелиальной системы костного мозга, селезенки, печени происходит распад гемоглобина. Конечным продуктом распада гема является непрямой билирубин, который поступает в кровь и транспортируется альбуминами в печень, где происходит его обезвреживание с образованием прямого билирубина.

В сыворотке крови имеется два вида билирубина. Основная форма - это непрямой (свободный) билирубин, который не связан с глюкуроновой кислотой и дает непрямую диазореакцию. В крови содержится незначительное количество прямого (связанного) билирубина - этот билирубин связан с глюкуронатом и дает прямую диазореакцию. Сумма обоих пигментов дает общий билирубин.

Нарушение обмена билирубина сопровождается развитием желтухи. В связи с этим раздельное количественное определение общего, прямого и непрямого билирубина в сыворотке крови имеет значение для дифференциальной диагностики различных типов желтух.

ПРИНЦИП МЕТОДА: диазореактив дает с прямым билирубином розовое окрашивание. Непрямой билирубин переводят в растворимое состояние добавлением к сыворотке кофеинового реактива, после этого общий билирубин определяется диазореакцией. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации билирубина в пробе.

ХОД РАБОТЫ: взять три пробирки: опыт 1, 2 и контроль.

ОТМЕРИТЬ			КОНТРОЛЬ
	БИЛИРУБИН	БИЛИРУБИН
СЫВОРОТКА КРОВИ ДИАЗОРЕАКТИВ КОФЕИНОВЫЙ

Содержимое пробирок перемешать и инкубировать

при температуре 18оС.

О ПЫТ 1 - фотометрия через 10 минут

п ротив контроля

ОПЫТ 2 - фотометрия через 20 минут

Длина волны: 530-550 нм, кювета 5 мм.

РЕЗУЛЬТАТ:

КОНЕЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ: находят по калибровочному графику. По разнице между количеством общего и прямого билирубина определяют уровень непрямого билирубина.

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.

Нормальное содержание общего билирубина в сыворотке крови 5,0 - 20,5 мкмоль/л; связанного билирубина (прямого) – 1,0 - 7,5 мкмоль/л; свободного билирубина (непрямого) – 1,7 – 17,1 мкмоль/л.

Повышенное содержание общего билирубина в сыворотке крови отмечается при желтухе новорожденных, повреждении гепатоцитов (воспалительном, токсическом), закупорке желчных протоков, гемолитической болезни.

При паренхиматозной желтухе:

В крови повышается содержание прямого и непрямого билирубина;

В моче появляется прямой билирубин и уробилиноген.

При обтурационной (механической) желтухе:

В крови повышается содержание прямого билирубина;

В моче появляется прямой билирубин (темная моча);

Уменьшается выделение стеркобилина (бесцветный кал).

При гемолитической желтухе:

В крови повышается содержание непрямого билирубина;

В моче повышается содержание стеркобилиногена;

Увеличивается выделение стеркобилина (темный кал).

ВЫВОД:

Содержание мочевины в сыворотке крови 20-40 мг% или 2,5-8,32 м моль /л.

Лабораторная работа №15

Количественное определение витамина с

В сыворотке крови

Принцип метода : количественного определения витамина С в сыворотки крови основан на его способности восстанавливать 2,6- дихлорфенолиндофенол, который в щелочной среде имеет синюю окраску, а в кислой красную.

Ход работы : К 5 мл сыворотки крови добавляют равный объем 20% сульфосалициловой кислоты для осаждения белков. Выпавший в осадок белок отфильтровывают, 6 мл фильтрата наливают в колбу для титрования (это будет соответствовать 3 мл сыворотки крови) и титруют из микробюретки 0,001 н раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до розового окрашивания, не исчезающего в течение 30 секунд. Подсчитывать содержание витамина С в крови по формуле:

г эквив. витамина С х А х 100

Х= _________________________________ =мг %

Г - эквив. Витамина С-граммэквивалент вит С =88

Н - нормальность р-ра 2,6-дихлорфенолиндофенола =0,001

А - количество мл 2,6-дихлофенолиндофенола, пошедшего на титрование.

В - количество мл сыворотки, взятой в опыт (3мл)

100-коэфициент для пересчета в мг%

Норма: 0,8-1,2 мг%.

Лабораторная работа №16 определение содержания витамина с в моче

Определение содержания витамина С в моче дает представление о запасах этого витамина в организме, так как наблюдается соответствие концентрации витамина С в крови и количество этого витамина, выделяемого с мочой.

Ход работы : в коническую колбочку отмеривают 10 мл мочи и 10 мл дистиллированной воды, перемешивают, подкисляют 1мл концентрированной уксусной кислоты и титруют 0,001 н раствором 2,6- дихлорфенолиндофенола до розового окрашивания.

Подсчитывают содержание витамина С по формуле:

0,088 х А х 1500

Х=________________= мг/сутки

А- количество 0,001н раствора 2,6 дихлорфенолиндофенола в мл, израсходованное на титрование

10-количество мочи, взятой для титрования

1500-ориентировочно взятое количество мочи.

Норма: 10-20 мг/сутки.

Лабораторная работа №17 коагуляционная проба вельтмана

Значение метода : Сыворотку крови можно представить как коллоидную систему, устойчивость которых зависит от содержания белковых фракций крови и соотношения между ними. Повышенной устойчивостью обладают альбумины – белки, с малыми размерами молекул, выраженным электрич. зарядом и высокой степенью гидратации. У глобулинов-большие размеры молекул сочетаются с меньшим зарядом и более низкой степенью гидратации. В связи с этими особенностями устойчивость глобулинов значительно ниже. Коллоидная устойчивость сыворотки крови уменьшается при снижении фракции альбуминов, при заболеваниях печени (гепатит, цирроз, острая желтая атрофия печени), при гемолитических состояниях. Также считают, что коагуляционная проба снижена при повышении содержания гамма-глобулинов, снижающих стабильность сыворотки. Увеличение пробы наблюдается при острых воспалительных и эксудативных процессах, когда увеличивается кол-во альфа- и бета- глобулинов, повышающих стабильность сыворотки.(эксудативная фаза ревматизма, активный процесс туберкулеза легких, злокачественных опухолей, больших потерях жидкости, острых инфекционных заболеваниях). В клинико-диагностических лабораториях широко используют методы при которых реакциями коагуляции обнаруживают изменения в составе белков сыворотки крови. Одним из таких методов является коагуляционная проба Вельтмана.

Принцип метода: Устойчивость р-ров высокомолекулярных соединений (белков) зависит от 2-х факторов: величины заряда молекул и степени их сольватации. В пробе Вельтмана для получения коагуляции белков сыворотки крови используется раствор СаСI2, который как электролит снижает заряд молекул и тепловую денатурацию, в результате которой молекулы белка приобретают гидрофобные свойства и теряют гидратную оболочку.

Ход работы : К 0,1 мл сыворотки крови прибавляют 4,9 мл дистил., воды, перемешивают и прибавляют 0,1 мл раствора СаСI2, встряхивают и нагревают на пламени до однократного

закипания. Охлаждают и на свету наблюдают за появлением коагуляции белка. Если белки не коагулировали, то добавляют еще 0,1 мл СаСI2 и вновь кипятят. Процедуру повторяют до тех

пор, пока не выпадут хлопья. Результаты оценивают, подсчитывая общее количество 0,5% раствора СаСI2 пошедшего на реакцию. В норме реакция наступает при добавлении 0,4- 0,5 мл СаСI2.

Работа №8 Определение содержания мочевины в сыворотке крови и моче по цветной реакции с диацетилмонооксимом

Принцип метода.

Мочевина образует с диацетилмонооксимом в сильнокислой среде в присутствии тиосемикарбазида и ионов трехвалентного железа красный комплекс.

Реактивы.

1. Стандартный раствор (10 мл)

мочевина 16,65 ммоль/л

2. Диацетилмонооксим (10 таблеток)

каждая таблетка содержит диацетилмонооксим 0,5 ммоль, тиосемикарбазид

0,08 ммоль, соль трехвалентного железа 2,5 мкмоль.

Состав реакционной смеси.

Диацетилмонооксим 5,0 ммоль/л

Тиосемикарбазид 0,9 ммоль/л

Кислота серная 0,9 моль/л

Соль железа трехвалентного 25,0 мкмоль/л

Соотношение сыворотка/ реакционная смесь 1/121

Приготовление рабочих растворов.

Раствор 1 . В мерной колбе вместимостью 50 мл растворяют в 30 мл дист. воды при повышенной температуре одну таблетку реактива 2. После охлаждения доливают водой до метки. Наличие небольшого нерастворимого осадка не мешает определению.

Устойчивость: несколько месяцев (с +15 до +25 С).

Раствор 2. Приготовляют смешиванием 1 доли Раствора 1 с 1 долей раствора серной кислоты.

Устойчивость: 1 день (с +15 до +25 С).

Проведение анализа.

Длина волны (490-540) нм

Кюветы 1 см

Температура (с +15 до +25 С)

В трех тонкостенных пробирках смешивают раствор 2 в соотношении 200 + 1 с сывороткой или разведенной мочой (проба), реактивом 1 (стандарт) или дистиллированной водой (контрольный раствор) и содержимое перемешивают. Мочу перед анализом разводят дист. водой от 1 + 50 до 1 + 100 (результат х разведение).

Расчет.

Мочевина (ммоль/л) = 16,65 х (А 1 / А 2)

Предупреждение.

Моче- 333,0 - 582,8 ммоль/сут.

Принцип метода

Мочевина образует с диацетилмонооксимом в сильнокислой среде в присутствии тиосемикарбазида и ионов трехвалентного железа красный комплекс.

Необходимые реактивы

1. Трихлоруксусная кислота, 100 г/л.

2. Диацетилмонооксим, 25 г/л водный раствор. Реактив стабилен.

3. Тиосемикарбазид, 2,5 г/л водный раствор. Для приготовления реактива можно пользоваться также тиосемикарбазида гидрохлоридом; последний применяется в виде 3,2 г/л водного раствора. Оба реактива стабильны при хранении в темной посуде при комнатной температуре.

4. Серная кислота концентрированная.

5. Ортофосфорная кислота 85%-ная.

6. Хлорное железо. Основной раствор хлорного железа: 5 г хлорного железа доводят до 100 мл водой и подкисляют добавлением 1 мл концентрированной серной кислоты. Из основного раствора готовят рабочий раствор хлорного железа: 1 мл основного раствора хлорного железа доводят до 100 мл водой, затем добавляют 8 мл концентрированной серной кислоты и 1 мл 85%-ной ортофосфорной кислоты.
Хранят в темной посуде. Годен в течение 2 недель.

7. Бензойная кислота, 2 г/л. 0,2 г кристаллической бензойной кислоты растворяют в 100 мл воды при интенсивном перемешивании на водяной бане.

8. Мочевина для приготовления калибровочного раствора. Готовят 7 ммоль/л раствор мочевины: 42 мг мочевины растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл. В качестве растворителя можно использовать 2 г/л раствор бензойной кислоты. Калибровочный раствор, приготовленный на растворе бензойной кислоты, стабильнее, чем водный; 1 мл калибровочного раствора содержит 0,007 ммоль мочевины.

9. Цветной реактив: к 30 мл рабочего раствора хлорного железа добавляют 20 мл воды, 1 мл 25 г/л раствора диацетилмонооксима и 0,25 мл 2,5 г/л раствора тиосемикарбазида. Цветной реактив готовят каждый раз перед употреблением.

Ход определения мочевины в сыворотке крови

Опытная проба: в центрифужную пробирку наливают 0,8 мл воды, 0,2 мл сыворотки и 1 мл 100 г/л раствора трихлоруксусной кислоты, смешивают.
Через 15-20 мин центрифугируют. В чистую пробирку вносят 0,5 мл надосадочной жидкости и 5 мл цветного реактива. Пробирку выдерживают на кипящей водяной бане в течение 20 мин, затем охлаждают в течение 2-3 мин под проточной водой. Измерение проводят на фотометре при длине волны 530-560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы в кювете с толщиной слоя в 1 см. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но вместо надосадочной жидкости берут 0,5 мл воды.

Расчет проводят по формуле путем сравнения с калибровочной пробой. Калибровочную пробу ставят аналогично опытной, но вместо сыворотки берут 0,2 мл калибровочного раствора.

Концентрация мочевины, ммоль/л:

Еоп / Ек ґ Ск,

Где Еоп - экстинкция опытной пробы;

Ск - концентрация мочевины в калибровочном растворе, 7 ммоль/л.
Определение мочевины в моче проводят аналогично определению мочевины в сыворотке крови, но вместо сыворотки берут 0,2 мл разведенной мочи.
Параллельно обрабатывают калибровочную пробу, как описано для определения мочевины в сыворотке крови.

Расчет мочевины на суточное количество мочи производят по следующей формуле:

Мсут = Ск ґ Еоп ґ а ґ К / Ек ґ б,

Где Мсут - количество мочевины в суточной моче, ммоль;

Еоп - экстинкция опытной пробы;

Ек - экстинкция калибровочной пробы;

А - суточное количество мочи, мл;

Б - количество мочи, взятое на анализ, мл;

К - коэффициент разведения мочи.

Примечания

1. Измерение проводят не позже чем через 15 мин после охлаждения проб ввиду неустойчивости окраски.

2. Из-за неустойчивости окрашенного комплекса мочевины с диацетилмонооксимом и зависимости окраски от условий нагревания калибровочную пробу определяют параллельно каждой серии опыта.

3.
При содержании мочевины в сыворотке крови выше 17 ммоль/л сыворотку разводят изотоническим раствором хлорида натрия, а результаты умножают на коэффициент разведения.

4. Для пересчета на азот мочевины результаты следует разделить на 2,14.

(диацетилмонооксимный метод)

Мочевина - продукт, образующийся в печени при обезвреживании аммиака. Мочевина – основной конечный продукт обмена белков. Примерно 50% небелкового, остаточного азота крови приходится на долю мочевины.

ПРИНЦИП МЕТОДА: мочевина образует с диацетилмонооксимом в сильнокислой среде в присутствии тиосемикарбазида и ионов трехвалентного железа комплексное соединение красного цвета, по интенсивности окраски которого определяют ее концентрацию.

ХОД РАБОТЫ: взять три пробирки: опыт, стандарт, контроль.

Все пробирки поместить в водяную баню при температуре 100 о С в течение 5 минут.

Охладить и произвести измерение экстинкции против контроля при 500-560 нм; кювета 5 мм. Измерения проводят в пределах 15 минут.

РЕЗУЛЬТАТ :

С ст = 16,65 ммоль/л.

КОНЕЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ: рассчитывают по формуле:

С оп = ----- · 16,65 = ммоль/л.

Нормальное содержание мочевины в сыворотке крови у взрослых 2,5 - 8,33 ммоль/л; в моче 333 - 582 ммоль/сут. У новорожденных в сыворотке крови нормальное содержание мочевины составляет 3,5 – 11 ммоль/л, у детей 2-14 лет 2,5 – 8,33 ммоль/л.

Незначительное повышение концентрации мочевины в сыворотке крови наблюдается при избыточном питании белковыми продуктами, при старении.

Значительное увеличение концентрации мочевины в сыворотке крови (уремия) наблюдается при почечной недостаточности, обезвоживании (рвота, понос), шоке, усиленном распаде белков, сепсисе.

Пониженное содержание мочевины в сыворотке крови отмечается при паренхиматозном гепатите, циррозе (резкое снижение мочевинообразовательной функции печени), эклампсии, во время беременности.

Пониженное содержание мочевины в моче отмечается при нефрите, ацидозе, паренхиматозной желтухе, циррозе печени

ВЫВОД:

Дата ________________

ЗАНЯТИЕ № 31

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ АУДИТОРНАЯ РАБОТА

ПО ТЕМЕ «ОБМЕН И ФУНКЦИИ АМИНОКИСЛОТ. ОБМЕН НУКЛЕОТИДОВ»

Задания для самостоятельной работы:

1. 1.Составить метаболическую карту аминокислотного обмена.

2. На карте отметить:

2.1. Источники аминокислот в тканях.

2.2. Пути превращения аминокислот в тканях.

2.3. Регуляторные ферменты гликолиза, метаболизма гликогена, глюконеогенеза, пентозофосфатного пути.

2.4. Витаминзависимые ферменты.

3. Решение и обсуждение ситуационных задач.

Дата: ________________

ЗАНЯТИЕ № 33

РАБОТА № 1. КАЧЕСТВЕННОЕ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИЛИРУБИНА
(ПО МЕТОДУ ЙЕНДРАШИКА)

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ. При разрушении эритроцитов (у человека через 100-120 дней) в клетках ретикулоэндотелиальной системы костного мозга, селезенки, печени происходит распад гемоглобина. Конечным продуктом распада гема является непрямой билирубин, который поступает в кровь и транспортируется альбуминами в печень, где происходит его обезвреживание с образованием прямого билирубина.

В сыворотке крови имеется два вида билирубина. Основная форма - это непрямой (свободный) билирубин, который не связан с глюкуроновой кислотой и дает непрямую диазореакцию. В крови содержится незначительное количество прямого (связанного) билирубина - этот билирубин связан с глюкуронатом и дает прямую диазореакцию. Сумма обоих пигментов дает общий билирубин.

Нарушение обмена билирубина сопровождается развитием желтухи. В связи с этим раздельное количественное определение общего, прямого и непрямого билирубина в сыворотке крови имеет значение для дифференциальной диагностики различных типов желтух.

ПРИНЦИП МЕТОДА: диазореактив дает с прямым билирубином розовое окрашивание. Непрямой билирубин переводят в растворимое состояние добавлением к сыворотке кофеинового реактива, после этого общий билирубин определяется диазореакцией. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации билирубина в пробе.

ХОД РАБОТЫ: взять три пробирки: опыт 1, 2 и контроль.

Содержимое пробирок перемешать и инкубировать

при температуре 18 о С.

ОПЫТ 1 - фотометрия через 10 минут

Против контроля

ОПЫТ 2 - фотометрия через 20 минут

Длина волны: 530-550 нм, кювета 5 мм.

РЕЗУЛЬТАТ:

КОНЕЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ: находят по калибровочному графику. По разнице между количеством общего и прямого билирубина определяют уровень непрямого билирубина.

Прямой билирубин:

С = мкмоль/л

Общий билирубин:

С = мкмоль/л

Непрямой билирубин:

С = мкмоль/л

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.

Нормальное содержание общего билирубина в сыворотке крови у взрослых 5,0 - 20,5 мкмоль/л; связанного билирубина (прямого) – 1,0 - 7,5 мкмоль/л; свободного билирубина (непрямого) – 1,7 - 17,1 мкмоль/л.

У новорожденных нормальное содержание общего билирубина в сыворотке крови составляет 12 – 20 мкмоль/л, у детей 2-14 лет 8,55 – 20,52 мкмоль/л.

Повышенное содержание общего билирубина в сыворотке крови отмечается при желтухе новорожденных, повреждении гепатоцитов (воспалительном, токсическом), закупорке желчных протоков, гемолитической болезни.

При паренхиматозной желтухе:

В крови повышается содержание прямого и непрямого билирубина;

В моче появляется прямой билирубин и уробилиноген.

Уменьшается выделение стеркобилина с калом.

При обтурационной (механической) желтухе:

В крови повышается содержание прямого билирубина;

В моче появляется прямой билирубин (темная моча);

Отсутствует выделение стеркобилина (ахолический кал).

При гемолитической желтухе:

В крови повышается содержание непрямого билирубина;

В моче повышается содержание стеркобилиногена;

Увеличивается выделение стеркобилина (темный кал).

ВЫВОД:

Дата ______________

ЗАНЯТИЕ № 34

Похожая информация.