« Couteau suisse » de l’armée virale : le secret de la transcriptase inverse a été percé. Transcriptase inverse Rôle dans le génie génétique
Transcriptase inverse (reversease ou ADN polymérase ARN-dépendante) est une enzyme qui catalyse la synthèse de l’ADN sur une matrice d’ARN dans un processus appelé « transcription inverse ». Le nom du processus reflète le contraire du processus transcriptions, réalisée dans l'autre sens : un transcrit d'ARN est synthétisé à partir d'une molécule matrice d'ADN.
Ces enzymes ont été isolées de virus à ARN ( rétrovirus). La transcriptase inverse est utilisée par les virus tumoraux pour transcrire l'ARNm dans le brin complémentaire de l'ADN. Lors de l'étude des rétrovirus dont le génome est représenté par des molécules d'ARN simple brin, il a été découvert qu'au cours du développement intracellulaire, le rétrovirus passe par l'étape d'intégration de son génome sous forme d'ADN double brin dans les chromosomes de l'hôte. cellule. En 1964, Temin émet l’hypothèse de l’existence d’une enzyme spécifique du virus, capable de synthétiser de l’ADN complémentaire sur une matrice d’ARN. Les efforts visant à isoler une telle enzyme ont été couronnés de succès et, en 1970, Temin et Mizutani, ainsi que, indépendamment, Baltimore ont découvert l'enzyme souhaitée dans une préparation de virions extracellulaires du virus du sarcome de Rous. Cette ADN polymérase ARN-dépendante est appelée transcriptase inverse, ou révertase.
La révertase des rétrovirus aviaires a été étudiée de manière très détaillée. Chaque virion contient environ 50 molécules de cette enzyme. La transcriptase inverse se compose de deux sous-unités - a (65 kDa) et b (95 kDa), présentes en quantités équimolaires. La transcriptase inverse a au moins trois activités enzymatiques :
1) ADN polymérase, qui utilise à la fois l’ARN et l’ADN comme matrice ;
2) l'activité de la RNase H, qui hydrolyse l'ARN dans le cadre d'un hybride ARN-ADN ;
3) Activité endonucléase de l'ADN.
Les deux premières activités sont nécessaires à la synthèse de l'ADN viral, et l'endonucléase semble être importante pour l'intégration de l'ADN viral dans le génome de la cellule hôte. La transcriptase inverse purifiée synthétise l'ADN sur des matrices d'ARN et d'ADN (Fig. 11).
Riz. 11. Schéma de synthèse de copies d'ADN double brin de molécules d'ARN
Pour commencer la synthèse, la reversetase, comme les autres polymérases, nécessite une courte région double brin (amorce). L'amorce peut être un segment simple brin d'ARN et d'ADN qui, au cours de la réaction, devient lié de manière covalente à la chaîne d'ADN nouvellement synthétisée. En génie génétique, on utilise à la fois des amorces oligo-(dT), complémentaires des extrémités 3"-polyA de l'ARNm, et un ensemble d'hexanucléotides « aléatoires » en termes de composition et de séquence (amorces aléatoires). Souvent pour des molécules d'ARN avec une amorce primaire connue. les séquences qui n'ont pas d'extrémités 3"- poly(A) utilisent des oligonucléotides synthétisés chimiquement complémentaires à l'extrémité 3"
La transcriptase inverse est principalement utilisée pour transcrire l'ARN messager en ADN complémentaire (ADNc). La réaction de transcription inverse est réalisée dans des conditions spécialement sélectionnées en utilisant de puissants inhibiteurs de l'activité RNase. Dans ce cas, il est possible d’obtenir des copies d’ADN complètes des molécules d’ARN cibles. Après la synthèse d'un brin d'ADN complémentaire sur l'ARNm et la destruction de l'ARN (un traitement alcalin est généralement utilisé), la synthèse du deuxième brin d'ADN est réalisée. Dans ce cas, la capacité de la reversetase à former des épingles à cheveux auto-complémentaires aux extrémités 3" des ADNc simple brin, qui peuvent servir d'amorce, est utilisée.
La matrice est le premier brin d'ADNc. Cette réaction peut être catalysée soit par la réversase, soit par l'ADN polymérase I d'E. coli. Il a été montré que la combinaison de ces deux enzymes permet d'augmenter le rendement en molécules d'ADNc double brin complètes. En fin de synthèse, les premier et deuxième brins d'ADNc restent liés de manière covalente par la boucle en épingle à cheveux qui a servi d'amorce lors de la synthèse du deuxième brin. Cette boucle est coupée par l'endonucléase S1, qui détruit spécifiquement les sections simple brin des acides nucléiques. Les extrémités formées dans ce cas ne sont pas toujours émoussées et, pour augmenter l'efficacité du clonage ultérieur, elles sont réparées pour devenir émoussées à l'aide du fragment de Klenow de l'ADN polymérase I d'E. coli. L'ADNc double brin résultant peut ensuite être inséré dans des vecteurs de clonage, propagé dans le cadre de molécules d'ADN hybrides et utilisé pour des recherches ultérieures.
Lors de l'étude des rétrovirus, dont le génome est représenté par des molécules d'ARN simple brin, il a été découvert qu'au cours du développement intracellulaire, ils passent par l'étape d'intégration de leur génome sous forme d'ADN double brin dans les chromosomes de la cellule hôte. En 1964, X. Temin émet l'hypothèse de l'existence d'une enzyme spécifique du virus, capable de synthétiser de l'ADN complémentaire sur une matrice d'ARN. En 1970, X. Temin et S. Mizutani, ainsi que indépendamment d'eux D. Baltimore, ont découvert une telle enzyme dans une préparation de virions extracellulaires du virus du sarcome de Rous. Cette ADN polymérase ARN-dépendante est appelée révertase (transcriptase inverse).
La révertase des rétrovirus aviaires a été étudiée de manière très détaillée. Chaque virion contient environ 50 molécules de cette enzyme. La transcriptase inverse se compose de deux sous-unités - ά (65 kDa) et β (95 kDa), présentes en quantités équimolaires. La sous-unité ά est la partie N-terminale (les deux tiers) de la sous-unité β.
La transcriptase inverse a au moins trois activités enzymatiques :
· ADN polymérase, qui utilise à la fois l'ARN et l'ADN comme matrice ;
· l'activité de la RNase H, qui hydrolyse l'ARN faisant partie d'un hybride ARN-ADN, mais pas l'ARN simple ou double brin ;
· ADN endonucléase.
Les deux premières activités sont nécessaires à la synthèse de l'ADN viral, et l'endonucléase semble être importante pour l'intégration de l'ADN viral dans le génome de la cellule hôte. La sous-unité β de la révertase possède les trois activités, tandis que la sous-unité ά ne possède que la polymérase et la RNase H.
La transcriptase inverse purifiée synthétise l'ADN à partir de matrices d'ARN et d'ADN. Pour commencer la synthèse, la reversetase, comme les autres polymérases, nécessite une courte région double brin – une amorce. L'amorce peut être un segment simple brin d'ARN et d'ADN qui, au cours de la réaction, devient lié de manière covalente à la chaîne d'ADN nouvellement synthétisée.
La transcriptase inverse est principalement utilisée pour transcrire l'ARN messager en ADN complémentaire (ADNc). La réaction de transcription inverse est réalisée en présence de puissants inhibiteurs de l'activité RNase. Dans ce cas, il est possible d’obtenir des copies d’ADN complètes des molécules d’ARN cibles. Oligo(dT) est utilisé comme amorce pour la transcription inverse des ARNm contenant du poly(A) (Fig.) et pour les molécules d'ARN qui n'ont pas d'extrémités poly(A) 3", des oligonucléotides synthétisés chimiquement complémentaires à l'extrémité 3". l’ARN étudié. De plus, ce dernier type de molécules d'ARN peut être converti en molécules contenant du poly(A) à l'aide de la polymérase poly(A) d'E. coli.
Après la synthèse d'un brin d'ADN complémentaire sur l'ARNm et la destruction de l'ARN (un traitement alcalin est généralement utilisé), la synthèse du deuxième brin d'ADN est réalisée. Dans ce cas, la capacité de la reversease à former des épingles à cheveux auto-complémentaires aux extrémités 3" des ADNc simple brin, qui peuvent servir d'amorce, est utilisée. La matrice est le premier brin de l'ADNc. Cette réaction peut être catalysée par à la fois la réversase et l'ADN polymérase I d'E. coli. La combinaison de ces deux enzymes permet d'augmenter le rendement en molécules d'ADNc double brin complètes.
En fin de synthèse, les premier et deuxième brins d'ADNc restent liés de manière covalente par la boucle en épingle à cheveux qui a servi d'amorce lors de la synthèse du deuxième brin. Cette boucle est coupée par l'endonucléase S1, qui détruit spécifiquement les sections simple brin des acides nucléiques. Les extrémités formées dans ce cas ne sont pas toujours émoussées et, pour augmenter l'efficacité du clonage ultérieur, elles sont réparées pour devenir émoussées à l'aide du fragment de Klenow de l'ADN polymérase I d'E. coli. L'ADNc double brin résultant peut ensuite être inséré dans des vecteurs de clonage, propagé dans le cadre de molécules d'ADN hybrides et utilisé pour des recherches ultérieures.
Transcriptase inverse (reversease ou ADN polymérase ARN-dépendante) est une enzyme qui catalyse la synthèse de l’ADN sur une matrice d’ARN dans un processus appelé « transcription inverse ». Le nom du processus reflète le contraire du processus transcriptions, réalisée dans l'autre sens : un transcrit d'ARN est synthétisé à partir d'une molécule matrice d'ADN.
Ces enzymes ont été isolées de virus à ARN ( rétrovirus). La transcriptase inverse est utilisée par les virus tumoraux pour transcrire l'ARNm dans le brin complémentaire de l'ADN. Lors de l'étude des rétrovirus dont le génome est représenté par des molécules d'ARN simple brin, il a été découvert qu'au cours du développement intracellulaire, le rétrovirus passe par l'étape d'intégration de son génome sous forme d'ADN double brin dans les chromosomes de l'hôte. cellule. En 1964, Temin émet l’hypothèse de l’existence d’une enzyme spécifique du virus, capable de synthétiser de l’ADN complémentaire sur une matrice d’ARN. Les efforts visant à isoler une telle enzyme ont été couronnés de succès et, en 1970, Temin et Mizutani, ainsi que, indépendamment, Baltimore ont découvert l'enzyme souhaitée dans une préparation de virions extracellulaires du virus du sarcome de Rous. Cette ADN polymérase ARN-dépendante est appelée transcriptase inverse, ou révertase.
La révertase des rétrovirus aviaires a été étudiée de manière très détaillée. Chaque virion contient environ 50 molécules de cette enzyme. La transcriptase inverse se compose de deux sous-unités - a (65 kDa) et b (95 kDa), présentes en quantités équimolaires. La transcriptase inverse a au moins trois activités enzymatiques :
1) ADN polymérase, qui utilise à la fois l’ARN et l’ADN comme matrice ;
2) l'activité de la RNase H, qui hydrolyse l'ARN dans le cadre d'un hybride ARN-ADN ;
3) Activité endonucléase de l'ADN.
Les deux premières activités sont nécessaires à la synthèse de l'ADN viral, et l'endonucléase semble être importante pour l'intégration de l'ADN viral dans le génome de la cellule hôte. La transcriptase inverse purifiée synthétise l'ADN sur des matrices d'ARN et d'ADN (Fig. 11).
Riz. 11. Schéma de synthèse de copies d'ADN double brin de molécules d'ARN
Pour commencer la synthèse, la reversetase, comme les autres polymérases, nécessite une courte région double brin (amorce). L'amorce peut être un segment simple brin d'ARN et d'ADN qui, au cours de la réaction, devient lié de manière covalente à la chaîne d'ADN nouvellement synthétisée. En génie génétique, on utilise à la fois des amorces oligo-(dT), complémentaires des extrémités 3"-polyA de l'ARNm, et un ensemble d'hexanucléotides « aléatoires » en termes de composition et de séquence (amorces aléatoires). Souvent pour des molécules d'ARN avec une amorce primaire connue. les séquences qui n'ont pas d'extrémités 3"- poly(A) utilisent des oligonucléotides synthétisés chimiquement complémentaires à l'extrémité 3"
La transcriptase inverse est principalement utilisée pour transcrire l'ARN messager en ADN complémentaire (ADNc). La réaction de transcription inverse est réalisée dans des conditions spécialement sélectionnées en utilisant de puissants inhibiteurs de l'activité RNase. Dans ce cas, il est possible d’obtenir des copies d’ADN complètes des molécules d’ARN cibles. Après la synthèse d'un brin d'ADN complémentaire sur l'ARNm et la destruction de l'ARN (un traitement alcalin est généralement utilisé), la synthèse du deuxième brin d'ADN est réalisée. Dans ce cas, la capacité de la reversetase à former des épingles à cheveux auto-complémentaires aux extrémités 3" des ADNc simple brin, qui peuvent servir d'amorce, est utilisée.
La matrice est le premier brin d'ADNc. Cette réaction peut être catalysée soit par la réversase, soit par l'ADN polymérase I d'E. coli. Il a été montré que la combinaison de ces deux enzymes permet d'augmenter le rendement en molécules d'ADNc double brin complètes. En fin de synthèse, les premier et deuxième brins d'ADNc restent liés de manière covalente par la boucle en épingle à cheveux qui a servi d'amorce lors de la synthèse du deuxième brin. Cette boucle est coupée par l'endonucléase S1, qui détruit spécifiquement les sections simple brin des acides nucléiques. Les extrémités formées dans ce cas ne sont pas toujours émoussées et, pour augmenter l'efficacité du clonage ultérieur, elles sont réparées pour devenir émoussées à l'aide du fragment de Klenow de l'ADN polymérase I d'E. coli. L'ADNc double brin résultant peut ensuite être inséré dans des vecteurs de clonage, propagé dans le cadre de molécules d'ADN hybrides et utilisé pour des recherches ultérieures.
La révertase est une enzyme qui synthétise l'ADNc sur une matrice d'ARN.
Pour certains virus, le génome n’est pas de l’ADN, comme d’habitude, mais de l’ARN. Ces virus étaient appelés rétrovirus (rétro-inverse). En 1970, D. Baltimore et Kh.M Temin ont découvert le mécanisme de transfert d'informations de l'ARN viral vers l'ADN, c'est-à-dire le contraire de ce qui se passe dans les cellules des organismes supérieurs. Ce processus est appelé transcription inverse et l’enzyme qui le réalise est appelée transcriptase inverse ou révertase.
Transcriptase inverse, ou transcriptase inverse, [lat. transcription- réécriture) - l'enzyme ADN polymérase ARN-dépendante, à l'aide de laquelle est réalisée la transcription inverse - la synthèse de l'ADN sur une matrice d'ARN ; codé par les génomes de certains virus à ARN et les éléments génétiques mobiles du génome d’organismes supérieurs, un « outil » important pour le génie génétique. La transcriptase inverse a au moins trois activités enzymatiques :
1) ADN polymérase, qui utilise à la fois l’ARN et l’ADN comme matrice ;
2) l'activité de la RNase H, qui hydrolyse l'ARN dans le cadre d'un hybride ARN-ADN, mais pas l'ARN simple ou double brin et
3) Activité endonucléase de l'ADN.
Découvert indépendamment par D. Baltimore et H. Temin en 1970 dans des virus tumoraux à ARN (Prix Nobel 1975 avec R. Dulbecco).
Ainsi, les transcriptases inverses sont capables de synthétiser de l’ADN sur une matrice d’ARN en polymérisant quatre désoxyribonucléoside triphosphates. Et tout comme les ADN polymérases, elles ne fonctionnent qu’en présence d’une amorce.
Les transcriptases inverses sont utilisées dans la synthèse de l'ADN double brin, complémentaire de l'ARN (notamment l'ARNm), pour son clonage ultérieur dans des vecteurs plasmidiques lors de l'obtention de bibliothèques d'ADNc (clonoteks). Les transcriptases inverses, comme les ADN polymérases, peuvent être utilisées pour introduire un marqueur radioactif ou fluorescent dans les sondes ADN dans des désoxyribonucléoside triphosphates correctement marqués.
La capacité à synthétiser de l'ADN sur une matrice d'ARN dans certaines conditions a été démontrée pour l'ADN polymérase thermostable de Thermus thermophilus. Cela lui permet d’être utilisé pour la détection directe d’ARN spécifiques dans des échantillons biologiques par PCR. Les modifications modernes de cette approche permettent, dans un mélange réactionnel (et un tube à essai), de synthétiser dans une réaction de transcription inverse un petit nombre de copies du fragment d'ADN amplifié sur une matrice d'ARN, qui sont immédiatement utilisées par la même enzyme que un modèle en PCR conventionnelle (one tube PCR).