«Швейцарский нож» вирусной армии: разгадан секрет обратной транскриптазы. Обратная транскриптаза Роль в генетической инженерии

Обратная транскриптаза (ревертаза или РНК-зависимая ДНК-полимераза ) представляет собой фермент, катализирующий синтез ДНК на матрице РНК в процессе, который получил название “обратная транскрипция” . Название процесса отражает противоположность процессу транскрипции , осуществляемой в другом направлении: с молекулы ДНК-матрицы синтезируется РНК-транскрипт.

Эти ферменты были выделены из РНК-содержащих вирусов (ретровирусов ). Обратная транскриптаза используется опухолеродными вирусами для транскрипции м-РНК в комплементарную цепь ДНК. При изучении ретровирусов, геном которых представлен молекулами одноцепочечной РНК, было обнаружено, что в процессе внутриклеточного развития ретровирус проходит стадию интеграции своего генома в виде двухцепочечной ДНК в хромосомы клетки-хозяина. В 1964 г. Темин выдвинул гипотезу о существовании вирусспецифичного фермента, способного синтезировать на РНК-матрице комплементарную ДНК. Усилия, направленные на выделение такого фермента, увенчались успехом, и в 1970 г. Темин с Мизутани, а также независимо от них Балтимор открыли искомый фермент в препарате внеклеточных вирионов вируса саркомы Рауса. Данная РНК-зависимая ДНК-полимераза получила название обратная транскриптаза, или ревертаза.

Наиболее детально изучена ревертаза ретровирусов птиц. Каждый вирион содержит около 50 молекул этого фермента. Обратная транскриптаза состоит из двух субъединиц - a (65 кДа) и b (95 кДа), присутствующих в эквимолярном количестве. Обратная транскриптаза обладает, по крайней мере, тремя ферментативными активностями:

1) ДНК-полимеразной, использующей в качестве матрицы как РНК, так и ДНК;

2) активностью РНКазы Н, гидролизующей РНК в составе гибрида РНК - ДНК;

3) ДНК-эндонуклеазной активностью.

Первые две активности необходимы для синтеза вирусной ДНК, а эндонуклеаза, по-видимому, важна для интеграции вирусной ДНК в геном клетки-хозяина. Очищенная обратная транскриптаза синтезирует ДНК как на РНК-, так и на ДНК-матрицах (рис. 11).

Рис. 11. Схема синтеза двухцепочечных ДНК-копий молекул РНК

Чтобы начать синтез, ревертазе, как и другим полимеразам, необходим короткий двухцепочечный участок (праймер). Праймером может служить одноцепочечный сегмент как РНК, так и ДНК, которые в процессе реакции оказываются ковалентно связанными с новосинтезированной цепью ДНК. В генетической инженерии используют как олиго-(дТ) праймеры, комплементарные 3"-полиА концам мРНК, так и набор “случайных” по составу и последовательности гексануклеотидов (random primers). Часто для молекул РНК с известной первичной последовательностью, не имеющих З"-поли (А) концов, используют химически синтезированные олигонуклеотиды, комплементарные З"-концу

Обратную транскриптазу преимущественно используют для транскрипции матричной РНК в комплементарную ДНК (кДНК). Реакцию обратной транскрипции проводят в специально подобранных условиях с использованием сильных ингибиторов РНКазной активности. При этом удается получать полноразмерные ДНК-копии целевых молекул РНК. После синтеза на мРНК комплементарной цепи ДНК и разрушения РНК (обычно применяют обработку щелочью) осуществляют синтез второй цепи ДНК. При этом используют способность ревертазы образовывать на 3"-концах одноцепочечных кДНК самокомплементарные шпильки, которые могут выполнять функции праймера.

Матрицей служит первая цепь кДНК. Данная реакция может катализироваться как ревертазой, так и ДНК-полимеразой I E. coli. Показано, что сочетание этих двух ферментов позволяет повысить выход полноценных двухцепочечных молекул кДНК. По окончании синтеза первая и вторая цепи кДНК остаются ковалентно связанными петлей шпильки, служившей праймером при синтезе второй цепи. Эту петлю расщепляют эндонуклеазой S1, специфически разрушающей одноцепочечные участки нуклеиновых кислот. Образующиеся при этом концы не всегда оказываются тупыми, и для повышения эффективности последующего клонирования их репарируют до тупых с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E. coli. Полученную двухцепочечную кДНК можно затем встраивать в клонирующие векторы, размножать в составе гибридных молекул ДНК и использовать для дальнейших исследований.

При изучении ретровирусов, геном которых представлен молекулами одноцепочечной РНК, было обнаружено, что в процессе внутрикле­точного развития они проходят стадию интег­рации своего генома в виде двухцепочечной ДНК в хромосомы клетки-хозяина. В 1964 г. X. Темин выдвинул гипотезу о существовании вирусспецифичного фермента, способного син­тезировать на РНК-матрице комплементарную ДНК. В 1970 г. X. Темин и С. Мизутани, а также независимо от них Д. Балтимор открыли такой фермент в препарате внеклеточных вирионов вируса саркомы Рауса. Данная РНК-зависимая ДНК-полимераза получила название ревертаза (обратная транскриптаза).

Наиболее детально изучена ревертаза рет­ровирусов птиц. Каждый вирион содержит око­ло 50 молекул этого фермента. Обратная транскриптаза состоит из двух субъединиц - ά (65 кДа) и β (95 кДа), присутствующих в эквимолярном количестве. ά -Субъединица пред­ставляет собой N-концевую часть (две трети) β-субъединицы.

Обратная транскриптаза обладает по край­ней мере тремя ферментативными активнос­тями:

· ДНК-полимеразной, использующей в ка­честве матрицы как РНК, так и ДНК;

· активностью РНКазы Н, гидролизующей РНК в составе гибрида РНК-ДНК, но не одно- или двухцепочечную РНК;

· ДНК-эндонуклеазной.

Первые две активности необходимы для син­теза вирусной ДНК, а эндонуклеаза, по-видимому, важна для интеграции вирусной ДНК в ге­ном клетки-хозяина. β-Субъединица ревертазы обладает всеми тремя активностями, в то время как ά-субъединица - только полимеразной и РНКазы Н.

Очищенная обратная транскриптаза синте­зирует ДНК как на РНК-, так и на ДНК-мат­рицах. Чтобы начать синтез, ревертазе, как и другим полимеразам, необходим короткий двухцепочечный участок - праймер. Праймером может служить одноцепочечный сегмент как РНК, так и ДНК, которые в процессе реак­ции оказываются ковалентно связанными с новосинтезированной цепью ДНК.

Обратную транскриптазу преимущественно используют для транскрипции матричной РНК в комплементарную ДНК (кДНК). Реакцию об­ратной транскрипции проводят в присутствии сильных ингибиторов РНКазной активности. При этом удается получать полноразмерные ДНК-копии целевых молекул РНК. В качестве праймера при обратной транскрипции поли (А)-содержащих мРНК используют олигo(dT) (рис.), а для молекул РНК, не имею­щих 3"-поли (А)-концов, - химически синтези­рованные олигонуклеотнды, комплементарные 3"-концу изучаемой РНК. Кроме того, послед­ний тип молекул РНК можно перевести в поли(А)-содержащие с помощью поли(А)-полимеразы Е. coli.

После синтеза на мРНК комплементарной цепи ДНК и разрушения РНК (обычно приме­няют обработку щелочью) осуществляют син­тез второй цепи ДНК. При этом используют способность ревертазы образовывать на 3"-кон­цах одноцепочечных кДНК самокомплементар­ные шпильки, которые могут выполнять функ­ции праймера. Матрицей служит первая цепь кДНК. Данная реакция может катализироваться как ревертазой, так и ДНК-полимеразой I E. co­li. Сочетание этих двух ферментов позволяет повысить выход полноценных двухцепочечных молекул кДНК.

По окончании синтеза первая и вторая цепи кДНК остаются ковалентно связанными петлей шпильки, служившей праймером при синтезе второй цепи. Эту петлю расщепляют эндонуклеазой S1, специфически разрушающей одноцепочечные участки нуклеиновых кислот. Об­разующиеся при этом концы не всегда оказы­ваются тупыми, и для повышения эффектив­ности последующего клонирования их репарируют до тупых с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E. coli. Полученную двухце­почечную кДНК можно затем встраивать в кло­нирующие векторы, размножать в составе гиб­ридных молекул ДНК и использовать для дальнейших исследований.

Обратная транскриптаза (ревертаза или РНК-зависимая ДНК-полимераза ) представляет собой фермент, катализирующий синтез ДНК на матрице РНК в процессе, который получил название “обратная транскрипция” . Название процесса отражает противоположность процессу транскрипции , осуществляемой в другом направлении: с молекулы ДНК-матрицы синтезируется РНК-транскрипт.

Эти ферменты были выделены из РНК-содержащих вирусов (ретровирусов ). Обратная транскриптаза используется опухолеродными вирусами для транскрипции м-РНК в комплементарную цепь ДНК. При изучении ретровирусов, геном которых представлен молекулами одноцепочечной РНК, было обнаружено, что в процессе внутриклеточного развития ретровирус проходит стадию интеграции своего генома в виде двухцепочечной ДНК в хромосомы клетки-хозяина. В 1964 г. Темин выдвинул гипотезу о существовании вирусспецифичного фермента, способного синтезировать на РНК-матрице комплементарную ДНК. Усилия, направленные на выделение такого фермента, увенчались успехом, и в 1970 г. Темин с Мизутани, а также независимо от них Балтимор открыли искомый фермент в препарате внеклеточных вирионов вируса саркомы Рауса. Данная РНК-зависимая ДНК-полимераза получила название обратная транскриптаза, или ревертаза.

Наиболее детально изучена ревертаза ретровирусов птиц. Каждый вирион содержит около 50 молекул этого фермента. Обратная транскриптаза состоит из двух субъединиц - a (65 кДа) и b (95 кДа), присутствующих в эквимолярном количестве. Обратная транскриптаза обладает, по крайней мере, тремя ферментативными активностями:

1) ДНК-полимеразной, использующей в качестве матрицы как РНК, так и ДНК;

2) активностью РНКазы Н, гидролизующей РНК в составе гибрида РНК - ДНК;

3) ДНК-эндонуклеазной активностью.

Первые две активности необходимы для синтеза вирусной ДНК, а эндонуклеаза, по-видимому, важна для интеграции вирусной ДНК в геном клетки-хозяина. Очищенная обратная транскриптаза синтезирует ДНК как на РНК-, так и на ДНК-матрицах (рис. 11).

Рис. 11. Схема синтеза двухцепочечных ДНК-копий молекул РНК

Чтобы начать синтез, ревертазе, как и другим полимеразам, необходим короткий двухцепочечный участок (праймер). Праймером может служить одноцепочечный сегмент как РНК, так и ДНК, которые в процессе реакции оказываются ковалентно связанными с новосинтезированной цепью ДНК. В генетической инженерии используют как олиго-(дТ) праймеры, комплементарные 3"-полиА концам мРНК, так и набор “случайных” по составу и последовательности гексануклеотидов (random primers). Часто для молекул РНК с известной первичной последовательностью, не имеющих З"-поли (А) концов, используют химически синтезированные олигонуклеотиды, комплементарные З"-концу

Обратную транскриптазу преимущественно используют для транскрипции матричной РНК в комплементарную ДНК (кДНК). Реакцию обратной транскрипции проводят в специально подобранных условиях с использованием сильных ингибиторов РНКазной активности. При этом удается получать полноразмерные ДНК-копии целевых молекул РНК. После синтеза на мРНК комплементарной цепи ДНК и разрушения РНК (обычно применяют обработку щелочью) осуществляют синтез второй цепи ДНК. При этом используют способность ревертазы образовывать на 3"-концах одноцепочечных кДНК самокомплементарные шпильки, которые могут выполнять функции праймера.

Матрицей служит первая цепь кДНК. Данная реакция может катализироваться как ревертазой, так и ДНК-полимеразой I E. coli. Показано, что сочетание этих двух ферментов позволяет повысить выход полноценных двухцепочечных молекул кДНК. По окончании синтеза первая и вторая цепи кДНК остаются ковалентно связанными петлей шпильки, служившей праймером при синтезе второй цепи. Эту петлю расщепляют эндонуклеазой S1, специфически разрушающей одноцепочечные участки нуклеиновых кислот. Образующиеся при этом концы не всегда оказываются тупыми, и для повышения эффективности последующего клонирования их репарируют до тупых с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E. coli. Полученную двухцепочечную кДНК можно затем встраивать в клонирующие векторы, размножать в составе гибридных молекул ДНК и использовать для дальнейших исследований.

Ревертаза - фермент, синтезирующий кДНК на матрице РНК.

У некоторых вирусов геномом служит не ДНК, как обычно, а РНК. Такие вирусы были названы ретровирусами (ретро - обратный). В 1970 г. Д.Балтимор и Х.М.Темин открыли механизм передачи информации от вирусной РНК к ДНК, т.е. наоборот тому, что имеет место в клетках высших организмов. Такой процесс получил название обратной транскрипции , а фермент, его осуществляющий, был назван обратной транскриптазой, или ревертазой (revertase).

Обратная транскриптаза, или ревертаза (reverse transcriptase, [лат. transcriptio - переписывание) - фермент РНК-зависимая ДНК-полимераза, с помощью которого осуществляется обратная транскрипция - синтез ДНК на матрице РНК; кодируется геномами некоторых РНК-содержащих вирусов и подвижных генетических элементов генома высших организмов, важный «инструмент» для гененой инженерии . Обратная транскриптаза обладает, по крайней мере, тремя ферментативными активностями:

1) ДНК-полимеразной, использующей в качестве матрицы как РНК, так и ДНК;

2) активностью РНКазы Н, гидролизующей РНК в составе гибрида РНК-ДНК, но не одно- или двухцепочечную РНК и

3) ДНК-эндонуклеазной активностью.

Открыта независимо друг от друга Д. Балтимором и Х. Теминым в 1970 г. в РНК-содержащих опухолеродных вирусах (Нобелевская премия за 1975 г. совместно с Р. Дульбекко).

Итак, обратные транскриптазы способны осуществлять синтез ДНК на матрице РНК, полимеризуя четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата. И так же, как и ДНК-полимеразы, функционируют только при наличии затравки.

Обратные транскриптазы применяются в синтезе двухцепочечных ДНК, комплементарных РНК (особенно мРНК), для последующего ее клонирования в плазмидных векторах при получении библиотек (клонотек) кДНК . Обратные транскриптазы, подобно ДНК-полимеразам, могут быть использованы для введения радиоактивной или флуоресцентной метки в ДНК-зонды в составе соответствующим образом меченных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов.

Способность синтезировать ДНК на матрице РНК в определенных условиях была продемонстрирована для термостабильной ДНК- полимеразы Thermus thermophilus . Это позволяет использовать ее для прямого обнаружения специфических РНК в биологических образцах методом ПЦР . Современные модификации такого подхода дают возможность в одной реакционной смеси (и пробирке) синтезировать в реакции обратной транскрипции небольшое число копий амплифицируемого фрагмента ДНК на матрице РНК, которые сразу же используются тем же ферментом в качестве матрицы в обычной ПЦР (one tube PCR).