Цитогенетический метод используют. Медицинская биология

Метод микроскопического изучения наследственных структур клетки - хромосом. Он включает кариотипирование и определение полового хроматина.

а) Кариотипирование проводится для получения метафазных хромосом.

Кариотип - это диплоидный набор хромосом в соматических клетках на стадии метафазы, характерный для данного вида.

Кариотип, представленный в виде диаграммы, называется идиограмма, кариограмма или хромосомный комплекс.

Для кариотипирования наиболее удобным источником клеток являются лимфоциты (клетки периферической крови). Вначале получают достаточное количество делящихся клеток (стимуляция ФГА), а затем метафазные пластинки (для остановки деления на стадии метафазы используют колхицин) с раздельно лежащими хромосомами (гипотонический раствор). Препараты окрашивают и фотографируют, хромосомы вырезают и раскладывают.

Для систематизации хромосом используют две стандартные классификации: Денверскую и Парижскую. В основу Денверской классификации положены два принципа: длина хромосом и их форма (метацентрические, субметацентрические, акроцентрические), при этом используется метод сплошной окраски хромосом. По этой классификации все хромосомы разделены на семь групп, каждая пара хромосом имеет свой номер. Недостатком классификации является трудность в идентификации хромосом внутри группы.

Парижская классификация основывается на дифференциальном окрашивании метафазных хромосом. Каждая хромосома имеет свой индивидуальный рисунок, четкую дифференциацию по длине на светлые и темные полосы - диски (сегменты). Разработана система обозначения линейной дифференциации хромосом (номер хромосомы, плечо, район, сегмент).

б) Определение Х-полового хроматина.

Половой хроматин (тельце Барра) - компактная темная глыбка, которая имеется в интерфазном ядре соматических клеток нормальных женщин. Половой хроматин представляет спирализованную Х-хромосому. Инактивация одной из Х-хромосом является механизмом, выравнивающим баланс генов в мужском и женском организме. Согласно гипотезе Марии Лайон, инактивация Х-хромосомы происходит на ранних стадиях эмбриогенеза (14 день), она носит случайный характер, причем инактивируются только длинные плечи Х-хромосомы. По числу глыбок полового хроматина можно судить о числе Х-хромосом (формула n+1, где n - число телец Барра). При любом числе Х-хромосом в активном состоянии будет только одна Х-хромосома. Цитогенетические методы используются для диагностики хромосомных болезней (изменение числа и структуры хромосом), определения пола, изучения хромосомного полиморфизма членов популяций.

Цитогенетический метод применяют в целях:

изучения кариотипа человека

диагностики хромосомных заболеваний

изучения мутагенного действия различных веществ при генных и хромосомных мутациях

составлении генетических карт хромосом

Этапы:

1. Культивирование клеток крови на питательных средах

2. Стимуляция митотических делений

3. Добавление колхицина для разрушения нитей веретена деления, остановка деления на стадии метафазы

4. Обработка клеток гипотоническим раствором для свободного расположения хромосом

5. Окрашивание

6. Микроскопирование и фотографирование

7. Построение идиограммы

Для качественной своевременной диагностики врожденных заболеваний, предрасположенности к онкологическим патологиям используется цитогенетическое исследование.

С помощью современных методик и новейшего оборудования изучается хромосомный набор плода.

Найденные аномалии в хромосомном аппарате позволят выявить и предотвратить возможные патологии еще до рождения ребенка.

Данная процедура отличается сложностью и многоступенчатостью, поэтому для решения каждой отдельной диагностической задачи требуется свое цитогенетическое специализированное обследование.

Цитогенетическое исследование изучает связи между наследственными факторами и ядерными структурами соматических клеток человека.

Данные методы анализа широко используются в биологии и медицине для определения происхождения, эволюции, изменчивости живых существ на протяжении филогенеза и онтогенеза.

Особое внимание уделяется индивидуальным генетическим особенностям. Именно поэтому главным предметом, с которым работает цитогенетический метод исследования, является хромосомный набор человека, животных и растений.

Изменения в хромосомах, передаваясь по наследству, определяют признаки организма, его подверженность различным заболеваниям, устойчивость к неблагоприятным факторам внешней среды.

Именно хромосомы определяют передачу некоторых заболеваний, поэтому по их набору и структурным изменениям можно увидеть предрасположенность конкретного человека к развитию онкологических и других тяжелых болезней.

Разнообразные структурные перестройки хромосом, аномалии хромосомного набора выявляет цитогенетический анализ и исследование.

Такие методики применяются для современной диагностики опасных заболеваний на начальных стадиях их развития.

На ранних стадиях беременности применение цитогенетического исследования хромосом плода позволяет определить пол будущего ребенка на клеточном уровне.

Высокотехнологичное оборудование последнего поколения, проверенные методики исследования позволяют обнаруживать и предотвращать онкологические заболевания и генетические патологии.

Точная диагностика дает возможность определить наиболее оптимальную тактику лечения, которая будет способствовать положительному терапевтическому результату.

Успешность такой процедуры зависит от качества, точности оборудования, квалификации, опыта медицинского персонала.

Точные данные анализа хромосом определяют успешность всего последующего лечения, поэтому необходимо стараться с первого раза получить правильные результаты.

Иногда данный вид диагностики оказывается единственно возможным. Эта технология исследования позволяет создать большое количество копий ДНК, которые исследуются различными способами, повышая достоверность результатов.

Выявленная на ранних стадиях болезнь лечится намного легче, а эффективная быстрая терапия зачастую спасает жизнь.

Исследование кариотип

Хромосомный набор (кариотип) изучается несколькими способами, которые используют различный биологический материал для анализов.

Исследование кариотип чаще всего работает с венозной кровью, которая смешивается в пробирке с литием и гепарином.

Забор крови производится в количестве 2 мл, после чего она содержится внутри питательной среды на протяжении 3 суток. Только после этого полученный материал фиксируется и исследуется под микроскопом.

За месяц до анализа хромосом следует отказаться от приема антибиотиков, кроме того, такие процедуры не проводятся при простудных заболеваниях.

Исследования кариотипа (кариотипирование) анализирует с помощью методики световой микроскопии форму, размер, число хромосом, используя специальное окрашивание. Нормальные показатели у мужчин обозначаются 46,XY, а у женщин – 46,XX.

Кариотипирование исследует структурные аномалии генетического материала, которые связаны с разрывами хромосом. Эти разрушения компенсируются с помощью различных нездоровых аномальных комбинаций.

С развитием современной медицинской техники появляются новые цитогенетические методики исследования, которые эффективно идентифицируют такие патологические изменения хромосом.

Если существуют подозрения на генетические отклонения в развитии эмбриона человека, то отдельно производится цитологический анализ плода.

Современные медицинские центры с хорошим оборудованием и квалифицированным персоналом выявляют различные пороки развития, хромосомные болезни, с достаточно высокой точностью определяют возможности благополучно выносить ребенка.

Если есть подозрения на онкологические заболевания органов системы кроветворения, то назначается цитологическое исследование костного мозга.

Такие анализы проводятся только в медицинских учреждениях, которые имеют специальное оборудование и квалифицированный персонал.

Это вызвано тем, что забор биологического материала для анализа и исследования связан с опасностью для здоровья и жизни.

С целью исключения хромосомных заболеваний плода на 3-4 месяце беременности проводится анализ хориона, который исследует не менее 20 клеток системы кроветворения.

Такое тестирование поможет предвидеть такие патологии, как болезнь Хантера, синдром Дауна и многие другие заболевания.

Изменение набора хромосом при онкологических процессах может быть использовано для ранней диагностики рака, поэтому диагностические исследования на цитологическом уровне активно развиваются с ростом технического прогресса.

Задачи анализа кариотипа и его виды

Подробное изучение кариотипа проводится для решения следующих конкретных задач:

• уточнения диагностического основания для назначения оптимального лечения онкологических заболеваний;
• выявления причины врожденных заболеваний ребенка на генетическом уровне;
• нахождение генетических причин выкидыша, женского бесплодия;
• выявление последствий воздействия вредных факторов на работе;
• обнаружения аномальных хромосом у плода.

Таким образом, показаниями к проведению подобного анализа являются бесплодие, прерывание беременности, подозрение на хромосомные патологии, отсутствие менструаций у женщин половозрелого возраста, нарушения и задержки полового развития.

Хромосомные аномалии у плода нередко могут становиться причиной неразвивающейся беременности.

В зависимости от уровней проведения анализ кариотипа бывает двух видов:

• обычным;
• молекулярным.

Если нарушение нормального кариотипа происходит на ранних стадиях полового развития человека, то при слиянии половых клеток и образовании зиготы такие аномалии сохраняются.

В дальнейшем развитии эмбрион сохраняет патологические неправильные хромосомы. Такое положение приводит к патологическим изменениям индивидуального развития, которые нередко оказываются нежизнеспособными.

Однако бывает положение, когда изначально при делении зиготы развивается несколько линий делений клеток, которые имеют разные кариотипы. Это позволяют выявить обычные цитогенетические методы исследования.

Молекулярное кариотипирование является самым современным методом исследования генома человека. С помощью такого анализа появилась возможность выявлять различные вариации числа копий генов.

Такие патологии характеризуются потерями участков молекул ДНК, которые содержат важную генетическую информацию. Все это приводит к умственной отсталости, эпилепсии, раку, аутизму.

С помощью этого метода можно достаточно точно определить гены, которые находятся в области перестройки, выяснить их непрямой или непосредственный вклад на развитие генетических заболеваний.

На сегодняшний день этот метод является важнейшим инструментом для постановки точного диагноза большинства генетических патологий.

Процедура кариотипирования

Набор внутри соматических клеток организма, состоящий из 23 пар хромосом, одна из которых передается от матери, а другая – от отца, представляет собой кариотип человека.

Для проведения анализа кариотипа используются любые клетки, которые могут быть получены из крови, костного мозга, эпителия человека.

На протяжении клеточного цикла внешний вид хромосом значительно меняется. На одних стадиях митоза они располагаются внутри ядра, не имеют спиральной формы, а на других образуется спиральная структура большего размера.

Наиболее подходящий для внешнего наблюдения этап клеточного деления – метафаза. Именно на этой стадии можно проводить микроскопическое исследование хромосом.

Исследовательская процедура проводится в следующем порядке:

1. Митоз останавливается на стадии метафазы и с помощью добавления колхицина, который фиксирует незаконченный процесс деления клеток, выделенная клеточная структура обогащается;
2. Такие клетки окрашиваются, фиксируются, после чего их фотографируют под микроскопом;
3. Полученные фотографии гомологичных хромосом систематизируются и выкладываются в определенном порядке.

С появлением методов дифференциальной окраски хромосом стала возможна их более подробная детализация при микроскопическом исследовании. Со временем эта методология совершенствовалась и развивалась.

Сдать анализ на определение кариотипа можно во многих специализированных клиниках. При этом такая процедура может проводиться в двух вариантах.

В первом случае анализируются количественные и структурные изменения хромосом, полученных от родителей.

Во втором анализируются внутренние мутации хромосом под влиянием неблагоприятных внешних факторов.

Нередко кариотипирование назначается супругам для определения причин бесплодия. При этом сдача биологического материала на анализ может происходить в разное время.

Таким образом, анализ кариотипов имеет большое значение в медицине, поскольку позволяет определять хромосомные перестройки, нарушения их структуры и порядка.

Цитогенетические обследования диагностируют ряд генетических заболеваний, которые напрямую связаны с хромосомами.

Цитогенетика – раздел генетики, изучающий закономерности наследственности и изменчивости на уровне клетки и субклеточных структур, главным образом хромосом. Цитогенетические методы предназначены для изучения структуры хромосомного набора или отдельных хромосом. Основа цитогенетических методов - микроскопическое изучение хромосом человека. Микроскопические методы исследования хромосом человека начали использоваться в конце XIX века. Термин «цитогенетика» введен в 1903 г. Уильямом Саттоном.

Цитогенетические исследования стали широко использоваться с начала 20 -х гг. XX в. для изучения морфологии хромосом человека, подсчета хромосом, культивирования лейкоцитов для получения метафазных пластинок. В 1959 г. французские ученые Д. Лежен, Р. Тюрпен и М. Готье установили хромосомную природу болезни Дауна. В последующие годы были описаны многие другие хромосомные синдромы, часто встречающиеся у человека. В 1960 году Р. Мурхед с соавт. разработали метод культивирования лимфоцитов периферической крови для получения метафазных хромосом человека, что позволило обнаруживать мутации хромосом, характерные для определенных наследственных болезней.

Применение цитогенетических методов: изучение нормального кариотипа человека, диагностика наследственных заболеваний, связанных с геномными и хромосомными мутациями, исследование мутагенного действия различных химических веществ, пестицидов, инсектицидов, лекарственных препаратов и др. Обьектом цитогенетичеких исследований могут быть делящиеся соматические, мейотические и интерфазные клетки.

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Световая микроскопия Электронная микроскопия Конфокальная микроскопия Люминесцентная микроскопия Флуоресцентная микроскопия

Показания для проведения цитогенетических исследований Подозрение на хромосомную болезнь по клинической симптоматике (для подтверждения диагноза) Наличие у ребенка множественных ВПР, не относящихся к генному синдрому Многократные спонтанные аборты, мертворождения или рождения детей с ВПР Нарушение репродуктивной функции неясного генеза у женщин и мужчин Существенная задержка умственного и физического развития у ребенка

Пренатальная диагностика (по возрасту, в связи с наличием транслокации у родителей, при рождении предыдущего ребенка с хромосомной болезнью) Подозрение на синдромы, характеризующиеся хромосомной нестабильностью Лейкозы (для дифференциальной диагностики, оценки эффективности лечения и прогноза лечения) Оценка мутагенных воздействий различных химических веществ, пестицидов, инсектицидов, лекарственных препаратов и др.

В период деления клеток на стадии метафазы хромосомы имеют более четкую структуру и доступны для изучения. Обычно исследуют лейкоциты периферической крови человека, которые помещают в специальную питательную среду, где они делятся. Затем готовят препараты и анализируют число и строение хромосом.

Цитогенетичекие исследования соматических клеток Получение препаратов митотических хромосом Окраска препаратов (простые, дифференциальные и флуоресцентные) Молекулярно-цитогенетические методы – метод цветной гибридизации in situ (FISH)

К цитогенетическим методам, применяемым в клинической практике, относятся: - классические методы кариотипирования; - молекулярно-цитогенетические методы. До недавнего времени диагностика хромосомных болезней базировалась на использовании традиционных методов цитогенетического анализа.

Для изучения хромосом чаще всего используют препараты кратковременной культуры крови, а также клетки костного мозга и культуры фибробластов. Кровь с антикоагулянтом центрифугированиют для осаждения эритроцитов, а лейкоциты инкубируют в культуральной среде 2 -3 дня. К образцу крови добавляют фитогемагглютинин, так как он ускоряет агглютинацию эритроцитов и стимулирует деление лимфоцитов. Наиболее подходящая фаза для исследования хромосом - метафаза митоза, поэтому для остановки деления лимфоцитов на этой стадии используют колхицин. Добавление этого препарата к культуре приводит к увеличению доли клеток, находящихся в метафазе, то есть в той стадии клеточного цикла, когда хромосомы видны лучше всего. Каждая хромосома реплицируется и после соответствующей окраски видна в виде двух хроматид, прикреплённых к центромере, или центральной перетяжке. Затем клетки обрабатывают гипотоническим раствором хлорида натрия, фиксируют и окрашивают. Для окраски хромосом чаще используют краситель Романовского -Гимзы, 2% ацеткармин или 2% ацетарсеин. Они окрашивают хромосомы целиком, равномерно (рутинный метод) и могут быть использованы для выявления численных аномалий хромосом

Денверская классификация хромосом человека (1960). Группа А (1 -3) – три пары самых крупных хромосом: две метацентрические и 1 субметацентрическая. Группа В – (4 -5) – две пары длинных субметацентрических хромосом. Группа С (6 -12) – 7 пар субметацентрических аутосом среднего размера и Х-хромосома. Группа D (13 -15) – три пары средних акроцентрических хромосом. Группа E (16 -18) – три пары метацинтрическая и субметацентрические хромосомы. Группа F (19 -20) – две пары маленьких метацентрических хромосом. Группа G (21 -22 и Y) – две пары мелких акроцентрических хромосом и Y-хромосома.

1. Рутинная (равномерная) окраска 2. Используется для анализа числа хромосом и выявления структурных нарушений (аберраций). При рутинной окраске достоверно можно идентифицировать только группу хромосом, при дифференциальной – все хромосомы

Идиограмма хромосом человека в соответствии с Денверской и Парижской классификациями A B C E D F G

Методы дифференциальной окраски хромосом Q-окрашивание - окрашивание по Касперссону акрихинипритом с исследованием под флуоресцентным микроскопом. Чаще всего применяется для исследования Y-хромосом. G-окрашивание - модифицированное окрашивание по Романовскому - Гимзе. Чувствительность выше, чем у Qокрашивания, поэтому используется как стандартный метод цитогенетического анализа. Применяется при выявлении небольших аберраций и маркерных хромосом (сегментированных иначе, чем нормальные гомологичные хромосомы) R-окрашивание - используется акридиновый оранжевый и подобные красители, при этом окрашиваются участки хромосом, нечувствительные к G-окрашиванию. C-окрашивание - применяется для анализа центромерных районов хромосом, содержащих конститутивный гетерохроматин. T-окрашивание - применяют для анализа теломерных районов хромосом.

Участки сильной и слабой конденсации по длине хромосомы специфичны для каждой хромосомы и имеют разную интенсивность окраски.

Флюоресцентная гибридизация in situ (Fluorescence in situ hybridization, FISH) - спектральное кариотипирование, состоящее в окрашивании хромосом набором флуоресцентных красителей, связывающихся со специфическими областями хромосом. В результате такого окрашивания гомологичные пары хромосом приобретают идентичные спектральные характеристики, что существенно облегчает выявление таких пар и обнаружение межхромосомных транслокаций, то есть перемещений участков между хромосомами - транслоцированные участки имеют спектр, отличающийся от спектра остальной хромосомы.

Флюоресцентная гибридизация in situ (Fluorescence in situ hybridization, FISH) Флюоресце нтная гибридиза ция in situ, или метод FISH - цитогенетический метод, который применяют для детекции и определения положения специфической последовательности ДНК на метафазных хромосомах или в интерфазных ядрах in situ. При флюоресцентной гибридизации in situ используют ДНК-зонды (ДНК-пробы), которые связываются с комплементарными мишенями в образце. В состав ДНК-зондов входят нуклеозиды, меченные флюорофорами (прямое мечение) или такими конъюгатами, как биотин или дигоксигенин (непрямое мечение).

Определение транслокации t(9; 22)(q 34; q 11) при хроническом миелолейкозе методом FISH ген ABL 1 (хромосомa 9) объединяется с геном BCR (хромосомы 22) – образуется химерный ген BCR-ABL 1. Метафазная пластинка с филадельфийской хромосомой. Хромосомы окрашены в синий цвет, локус ABL 1 - красный цвет, локус BCR - зелёный цвет. Вверху слева - хромосома с перестройкой, отмечена красно-зеленой точкой.

Многоцветная FISH - спектральное кариотипирование, состоящее в окрашивании хромосом набором флуоресцентных красителей, связывающихся со специфическими областями хромосом. В результате такого окрашивания гомологичные пары хромосом приобретают идентичные спектральные характеристики, что существенно облегчает выявление таких пар и обнаружение межхромосомных транслокаций, то есть перемещений участков между хромосомами - транслоцированные участки имеют спектр, отличающийся от спектра остальной хромосомы.

Кариотип 46, XY, t(1; 3)(p 21; q 21), del(9)(q 22) Транслокация между 1 -й и 3 -й хромосомами, делеция 9 -й хромосомы. Маркировка участков хромосом дана как по комплексам поперечных меток (классическая кариотипизация, полоски), так и по спектру флуоресценции (цвет, спектральная кариотипизация).

Среди многих методов изучения наследственной патологии человека цитогенетический метод занимает одно из главных. С помощью цитогенетического исследования в генетике человека можно решать такие сложные вопросы, как анализы материальных основ наследственности и кариотипа в норме и патологии, изучать некоторые закономерности мутационного и эволюционного процессов. Все хромосомные болезни у человека были открыты с помощью цитогенетического метода. Для его проведения используют культуру лимфоцитов периферической крови, кожные фибробласты, костный мозг. Классификация хромосом человека, методы индивидуализации

хромосом с помощью различных типов окрашивания, молекулярная организация хромосом, хромосомный пол человека - все эти темы будут освещены в практикуме по медицинской генетике, который выйдет в свет вскоре после настоящей монографии.

Цитогенетика человека занимает особое место в медицинской генетике. Это обусловлено тем, что большая часть множественных пороков и нарушений половой дифференцировки у человека связана с различными структурными и числовыми нарушениями в системе аутосом и гоносом. До недавнего времени с помощью цитогенетического метода можно было судить только о кариотипе - точном числе и структуре хромосом. С введением в практику здравоохранения высокоразрешающих методов молекулярной цитогенетики удалось «подобрать ключи» к патологии, которую не удавалось диагностировать с помощью рутинных методов цитогенетики. Были разработаны и внедрены в клиническую цитогенетику ДНК-диагностика, гибридизация нуклеиновых кислот in situ, которые помогли выяснить природу большого количества микроделеционных синдромов (Ворсанова С.Г. и соавт., 1998, 1999, 2006); появились компьютерные системы для анализа хромосом, которые позволяют проводить автоматический анализ хромосом и внедрять очень эффективную многоцветную детекцию ДНК-зондов. Весьма успешную работу в этом направлении осуществляют лаборатории Научного Центра психического здоровья (руководитель Юров Ю.Б.) и Московского НИИ педиатрии и детской хирургии (руководитель Ворсанова С.Г.), которые создали оригинальную хромосомоспецифическую коллекцию ДНК-зондов на все хромосомы человека и их отдельные участки.

Необходимость цитогенетического исследования диктуется наличием огромного количества хромосомных болезней. Описано уже около 1000 типов хромосомных нарушений, для более 100 из них четко определена клиническая картина. Частота хромосомных аномалий среди новорожденных составляет примерно 1%, среди мертворожденных этот показатель равен 6-7%. У детей, родившихся с задержкой психомоторного развития и имеющих пороки развития внутренних органов, хромосомные болезни встречаются от 1 до 30%. Кроме того, хорошо известно, что по крайней мере около 60% спонтанных абортов в I триместре беременности (в первые дни беременности эти цифры еще выше) связаны с хромосомными аберрациями.

Хромосомные нарушения резко нарушают эмбриогенез. В этот период, период морфогенеза в процессах развития будущего потомства принимают участие до 1000 генов, локализованных во всех хромосомах, поэтому хромосомная или геномная мутация может привести к спонтанному аборту (Бочков Н.П., 2004). Примерно 1 /з оплодотворенных яйцеклеток погибает в 1-ю неделю беременности. Во II триместре хромосомные нарушения являются причиной спонтанных абортов в 25-30% случаев. После 20 нед беременности хромосомные аномалии встречаются только в 10% случаев. При отягощенном акушерском анамнезе у супружеских пар с повторными спонтанными абортами, мертворождениями или рождением детей с пороками развития хромосомные аномалии обнаруживаются в 5%.

Среди других контингентов хромосомные аномалии обнаруживаются у детей с олигофренией - в среднем в 15% (в основном из-за структурных перестроек). У больных с нарушением половой дифференцировки частота хромосомных нарушений колеблется от 20 до 50% (в 50% случаев обнаруживается мозаицизм). У больных с первичной и вторичной аменореей частота хромосомных аномалий колеблется от 10 до 50% (более 90% - численные нарушения и мозаицизм). При мужском бесплодии частота аномальных хромосом достигает 10-15% (до 70% - численные нарушения и мозаицизм).

Знания по медицинской генетике, в том числе и по цитогенетике, необходимы акушерам-гинекологам, педиатрам, эндокринологам, психоневрологам, паталогоанатомам, а также другим специалистам. Имеется достаточное количество не только детей, но и взрослых больных, у которых психоневрологические нарушения, нарушения половой сферы или репродуктивной функции связаны с нарушением хромосомного аппарата.

Исторически хромосомные болезни клиницисты начали еще изучать до установления точного числа хромосом человека. Синдромы Дауна, Клайнфельтера и Шерешевского-Тернера клинически были описаны задолго до открытия хромосомной этиологии этих заболеваний.

С открытием «лишней» хромосомы при синдроме Дауна (Лежен Ж. и соавт., 1959) в медицину вошло новое понятие - «хромосомопатии», или «хромосомные болезни».

В настоящее время к хромосомным болезням относят такие формы патологии, при которых наблюдаются, как правило, нарушение психики и множественные врожденные пороки различных

систем организма человека. Генетической основой таких состояний являются численные или структурные изменения хромосом, наблюдаемые в соматических или половых клетках.

Термин «болезнь» по отношению к хромосомным аномалиям употребляется не всегда справедливо. Болезнь - это процессуальность, т.е. закономерная смена симптомов и синдромов во времени. Болезнь имеет продрому, начало, стадию полного развития и исходное состояние. Совокупность же специфических признаков, характеризующих любую хромосомную аномалию, является конституциональной, врожденной, и признаки эти непрогредиентны. Другими словами, врожденные аномалии развития, в основе которых лежат нарушения кариотипа, отличаются от болезней в обычном понимании резким сдвигом процессуальной фазы во времени. Процессуальная фаза в данном случае проходит во время эмбрионального развития. В силу этих соображений употребление термина «хромосомные болезни» необходимо применять при полном осознании его своеобразия.

Одной из важнейших задач медицинской генетики, и в первую очередь клинической цитогенетики человека, является выяснение связи хромосомных аномалий с пороками развития. Положительное решение этой проблемы позволило бы, в свою очередь, установить роль каждой отдельной хромосомы в эмбриональном развитии человека; это, конечно, помогло бы цитогенетикам составить цитологические карты каждого отдельного локуса хромосомы и таким образом определить значение его для развития и жизнедеятельности организма в целом.

3.2. ЭТИОЛОГИЯ И КЛАССИФИКАЦИЯ ХРОМОСОМНЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Среди хромосомных нарушений принято выделять геномные и хромосомные нарушения. У человека найдены все формы хромосомных и геномных мутаций. К геномным мутациям относятся аномалии, характеризующиеся увеличением полного набора хромосом (полиплоидии) или изменением количества хромосом по одной из пар (анеуплоидии). К структурным хромосомным мутациям относятся все типы перестроек, которые обнаружены у человека, - делеция (нехватка), дупликация (удвоение), инверсия (перевертывание), инсерция (вставка), транслокация (перемещение).

Можно выделить два основных типа перестроек: внутрихромосомные и межхромосомные. В свою очередь, перестройки могут быть сбалансированными (т.е. в геноме присутствуют все локусы, однако их расположение в хромосомах отличается от исходного - нормального) и несбалансированными. Несбалансированные перестройки характеризуются утратой или удвоением участков хромосомы. Внутрихромосомные перестройки, связанные с перестройками внутри одного плеча хромосомы, называются парацентрическими. Крайние участки без центромеры называются фрагментами, и они обычно утрачиваются в ходе митоза.

Делеция - утрата части хромосомы, происходящая в результате двух разрывов и одного воссоединения, с утратой сегмента, лежащего между разрывами. У человека известна потеря 1 /з короткого плеча хромосомы 5, именуемая как синдром «кошачьего крика» и описанная впервые Дж. Леженом в 1963 г.

Дупликация - удвоение сегмента хромосомы, в результате чего клетка организма становится полиплоидной по данному сегменту. Если дупликация находится непосредственно за исходным участком хромосомы, это называется тандем-дупликацией. Кроме того, дупликации могут быть локализованы в других участках хромосомы. Большинство таких перестроек летальны, а те люди, которые с ними выжили, как правило, не способны воспроизвести потомство.

В случае инверсии участок хромосомы разворачивается на 180°, и разорванные концы соединяются в новом порядке. Если в инвертированный участок попадает центромера, такую инверсию называют перицентрической. Если инверсия затрагивает только одно плечо хромосомы, она называется парацентрической. Гены в инвертированном участке хромосомы располагаются в обратном порядке по отношению к исходному в хромосоме.

К межхромосомным перестройкам относят транслокации - обмен сегментами между хромосомами. Различают следующие типы транслокаций:

Реципрокная транслокация, когда две хромосомы взаимно обмениваются сегментами (сбалансированная транслокация); как и инверсия, она не вызывает аномальных эффектов у носителя;

Нереципрокная транслокация - когда сегмент одной хромосомы переносится в другую;

Транслокация типа центрического соединения - когда после разрывов в околоцентромерном районе соединяются два фрагмента с центромерами таким образом, что их центромера соединяется, образуя одну. Взаимное объединение двух акроцентрических хромосом из групп D и G приводит к образованию одной метаили субметацентрической хромосомы. Такую транслокацию называют робертсоновской.

Рис. 3.3. Транслокация t(5;14)

Транслокационный синдром Дауна возникает именно таким образом, при этом больные имеют выраженную симптоматику болезни Дауна, но в их кариотипе всего 46 хромосом, причем хромосом 21 - две, третья транслоцирована обычно на одну из хромосом группы D или G. Исследование кариотипов родителей таких детей показало, что чаще всего фенотипически нормальные родители (как правило, матери) имеют 45 хромосом и точно такую же транслокацию хромосомы 21, как и ребенок.

В основу классификации хромосомных болезней положены тип хромосомной аномалии и характер дисбаланса хромосомного материала соответствующего кариотипа. Исходя из этих принципов хромосомные аномалии делятся на три группы:

Численные нарушения по отдельным хромосомам;

Нарушение кратности полного гаплоидного набора хромосом;

Структурные перестройки хромосом.

Первые две группы относятся к геномным мутациям, а третья группа - к хромосомным мутациям. Кроме этого, необходимо учитывать тип клеток, в которых произошла мутация (в гаметах или зиготе), а также иметь в виду, была ли мутация унаследована или она возникла заново. Таким образом, при постановке диагноза хромосомной болезни необходимо учитывать:

Тип мутации;

Конкретную хромосому;

Форму (полная или мозаичная);

Наследуемый или ненаследуемый случай.

Большая часть хромосомных аномалий, возникающих в хромосомных наборах человека, связана с нарушением числа хромосом. Полиплоидия возникает в результате нарушения нормального митотического цикла: удвоение хромосом не сопровождается делением ядра и клетки. Примерами полиплоидии, которые описаны у человека, являются триплоидии (69,ХХХ; 69,ХХУ) и тетраплоидии (92,ХХХХ; 92,ХХХУ). Эти нарушения несовместимы с жизнью и встречаются в материале спонтанных абортусов или плода и у мертворожденных, а иногда и у новорожденных, продолжительность жизни которых с такими аномалиями составляет, как правило, всего несколько дней.

Анеуплоидия возникает в результате нерасхождения хромосом в мейотических делениях или в митозе. Термин «нерасхождение» означает отсутствие разъединения хромосом (в мейозе) либо хроматид (в митозе) в анафазе. В результате нерасхождения возникают гаметы с аномальным набором хромосом.

Структурные изменения хромосом у человека встречаются намного реже, чем численные аберрации. Структурные перестройки могут быть хромосомными и хроматидными, сопровождаться изменением количества генетического материала (делеции и дупликации) или только сводиться к перемещению его (инверсии, инсерции, транслокации). В перестройку может вовлекаться одна или больше хромосом с несколькими разрывами и соединениями. Иногда в организме могут встречаться клетки с различными кариотипами. Такое сочетание кариотипа обычно обозначают термином «мозаицизм» .

Большинство хромосомных болезней возникает спорадически в результате геномной и хромосомной мутации в гаметах здоровых родителей или на первых делениях зиготы. Хромосомные изменения в гаметах приводят к развитию так называемых полных, или регулярных, форм нарушения кариотипа, а соответствующие изменения хромосом на ранних стадиях развития эмбриона являются причиной возникновения соматического мозаицизма или мозаичных организмов (наличие в организме двух или более клеточных линий с разным числом хромосом). Мозаицизм может касаться как половых хромосом, так и аутосом. У человека чаще всего мозаичные формы обнаруживаются в системе половых хромосом. Мозаики, как правило, имеют более «стертые» формы заболевания, чем люди с измененным числом хромосом в каждой клетке. Так, ребенок с мозаичным вариантом болезни Дауна может иметь фактически нормальный интеллект, но физические признаки этого заболевания все равно остаются.

Число аномальных клеток может быть различным: чем их больше, тем более ярко выражен симптомокомплекс той или иной хромосомной болезни. В некоторых случаях удельный вес аномальных клеток так невелик, что человек кажется фенотипически здоровым.

Установить мозаицизм оказывается не так просто, поскольку клон аномальных клеток имеет в онтогенезе тенденцию к элиминации. Иначе говоря, число таких клеток может быть у взрослого человека относительно мало, в то время как в эмбриональный и ранний постнатальный периоды их удельный вес был достаточно велик, что привело к развитию выраженных клинических симптомов болезни. Однако, несмотря на известные трудности изучения мозаицизма, его открытие и исследование вносят ясность в проблему стертых и рудиментарных форм хромосомных болезней.

Любая из хромосом кариотипа человека может вовлекаться в численные или структурные изменения. Исходя из этого можно наблюдать очень большое разнообразие описанных хромосомных форм. Практическая цитогенетика постоянно сталкивается с обнаружением хромосомных аномалий при исследовании различных клеток и тканей в разные периоды развития человека. Классификация индивидуальных хромосом, которые могут вовлекаться в хромосомные аномалии, а следовательно, и выделение хромосомных синдромов в настоящее время - легко разрешимая проблема в связи с введением в хромосомный анализ методов индивидуализации хромосом: различных типов окрашивания по длине; гибридизации нуклеино-

вых кислот in situ, метода сравнительной геномной гибридизации, спектроскопического метода анализа хромосом. В последнее время при FISH-анализе иногда используют разноцветные ДНК-зонды, позволяющие быстро выявить качественные и количественные перестройки хромосом.

3.3. ПАТОГЕНЕЗ И КЛИНИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ХРОМОСОМНЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Хромосомные аномалии возникают в результате того, что изменения количества или качества генетической информации в сторону ее избытка или недостатка нарушает функционирование нормальной генетической программы онтогенеза (индивидуального развития организма). Характер и тяжесть проявления хромосомных болезней зависит от вида аномалий и вовлеченных хромосом. Хромосомные синдромы обычно характеризуются множественными пороками развития независимо от типа хромосомной аберрации. Многочисленные исследования разнообразных типов повреждения хромосом и вызываемые ими отклонения развития позволяют сделать вывод о том, что в патогенезе хромосомных болезней основное место занимает нарушение физического (соматического) и психического развития.

Общим для всех форм хромосомных аномалий является множественность поражения различных систем и органов. Нарушения развития могут наблюдаться в широких диапазонах - от гибели и элиминации зигот на первых стадиях дробления до нарушений, совместимых с постнатальным существованием. Тщательное клинико-цитогенетическое изучение хромосомных аномалий позволяет выделить ряд признаков, которые в различных сочетаниях и с разной степенью выраженности встречаются у всех пораженных индивидуумов. К таким признакам относят умственную отсталость, пре- и постнатальную задержку развития, аномалии многих органных систем, особенно челюстно-лицевой области, скелета, сердечно-сосудистой и мочеполовой систем. В частности, отмечаются краниофациальная дисплазия, ненормальные форма и расположение ушных раковин, гипертелоризм, эпикант, готическое нёбо, аномалии строения глазных щелей и яблок, специфическое изменение кожного рисунка на ладонях и подошвах, аномалия строения и расположения пальцев нижних и верхних конечностей и др.

Все диагностические признаки, встречающиеся при хромосомных болезнях, можно условно разделить на три группы.

К первой группе можно отнести комплекс признаков, позволяющих лишь заподозрить хромосомную аномалию. Это общие признаки (некоторые из них перечислены выше): физическое недоразвитие, ряд дизморфий мозгового и лицевого черепа, косолапость, клинодактилия мизинцев, некоторые пороки развития внутренних органов (сердца, почек, легких).

Ко второй группе относят признаки, встречающиеся в основном при определенных хромосомных болезнях. Их сочетание позволяет в большинстве случаев диагностировать хромосомную аномалию. Среди характерных, наиболее часто встречающихся признаков при трисомии хромосомы 13 следует назвать глубокую задержку умственного и физического развития (100%), гипертелоризм (90%), низко расположенные уродливые уши (90%). При трисомии хромосомы 18 следует отметить долихоцефалию (90%), тяжелую задержку психомоторного и физического развития (100%), затруднения при глотании, проблемы с кормлением (100%), микрогнатию и короткую грудину (90%).

К третьей группе относят признаки, характерные только для одной хромосомной аномалии, например «кошачий крик» при синдроме 5р-, алопеция при синдроме 18р.

При изучении корреляции фенотипа с кариотипом было сделано важное заключение о том, что чем больше хромосомного материала утрачено или приобретено, тем сильнее отклонения в развитии, тем раньше в онтогенезе они проявляются. Поэтому аномалии по крупным хромосомам встречаются очень редко. Кроме того, нехватка генетического материала сказывается на организме тяжелее, чем его избыток, и поэтому полные моносомии (особенно у живорожденных детей) встречаются гораздо реже, чем полные трисомии. Тяжесть клинической картины зависит не только от размера хромосомы, вовлекаемой в патологический процесс, большое значение имеет и ее качественный состав. Например, полные трисомии у живорожденных чаще всего обнаруживаются по аутосомам 13, 18, 21. Это связано с тем, что данные хромосомы содержат больше гетерохроматина, чем эухроматина. Основу последнего составляют активные районы, содержащие гены, которые контролируют развитие признаков организма. И, естественно, скорее погибнет та клетка, в которой имеется нехватка генов, определяющих продукцию таких белков, которые

участвуют в ключевых биохимических реакциях, обеспечивающих жизнеспособность клетки.

Для хромосомных нарушений характерны увеличение частоты гибели плодов и снижение жизнеспособности живорожденных. Однако при некоторых хромосомных аномалиях возможно выживание до взрослого состояния. В первую очередь это относится к группе синдромов, связанных с патологией в системе половых хромосом. Общее нарушение генного баланса, вызванное аномалиями в системе половых хромосом, гораздо менее фатально для развития организма, чем это имеет место при аутосомных аберрациях, поэтому наличие гоносомных нарушений в кариотипе человека совместимо не только с рождением, но и с нормальной жизнеспособностью и даже иногда с нормальным фенотипом.

Многочисленные исследования, проведенные в больших популяциях новорожденных и здоровых взрослых, а также в различных контингентах умственно отсталых лиц, позволили установить, что аномалии по половым хромосомам среди умственно отсталых людей встречаются в 4-5 раз чаще, чем у новорожденных.

Установлено, что 17-25% мужчин с синдромом Клайнфельтера имеют сниженный интеллект. Лишняя хромосома Х у женщин, вероятно, проявляется в еще большем снижении интеллекта, чем у мужчин.

Отмечена прямая корреляция между числом лишних Х хромосом и степенью умственной отсталости. Если наличие одной лишней хромосомы Х не всегда сопровождается олигофренией (синдромы ХХУ, ХХХ), то наличие лишних двух Х хромосом уже всегда дает картину умственной отсталости (средние значения IQ у больных с кариотипом 48, ХХХУ 52,5, а с кариотипом 49, ХХХХУ - 35,2). Синдром Шерешевского-Тернера более редок среди умственно отсталых женщин.

Причины умственной отсталости при ауто- и гоносомных абберациях, очевидно, заключаются в грубых нарушениях генного баланса и вытекающих отсюда нарушениях множества ферментных функций.

Как уже указывалось выше, клинические проявления одних и тех же форм хромосомных болезней сильно варьируют: от летального эффекта до незначительных отклонений. Почему это происходит, остается неясным: ведущую роль играют то ли генотипические факторы, то ли факторы внешней среды. Например, нет ответа на вопрос,

почему только 2/3 случаев трисомии по хромосоме 21 элиминируется во внутриутробном периоде (примерно такая же картина наблюдается при моносомии ХО).

В формировании клинических (фенотипических) проявлений хромосомных аномалий участвуют многие факторы. Среди них в первую очередь следует отметить:

Генотип организма;

Генный состав индивидуальной хромосомы, вовлекаемой в хромосомную аберрацию;

Тип аберрации и размер недостающего или избыточного хромосомного материала;

Степень мозаичности организма по аберрантным клеткам.

Тяжесть клинических проявлений зависит от соотношения нормальных и аномальных клеточных клонов;

Факторы внешней среды;

Онтогенетическую стадию развития организма.

Исходя из приведенных данных следует сделать вывод о том, что в патогенезе хромосомных аномалий еще много неясного, поскольку пока нет общей четкой схемы развития сложных патологических процессов, каковыми являются хромосомные болезни.

3.4. ЧАСТОТА И РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ ХРОМОСОМНЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Наиболее полные сведения о частоте и распространенности хромосомных болезней можно получить на основании цитогенетических исследований спонтанных абортов, мертворожденных и новорожденных. Методы учета хромосомных аномалий должны быть строго унифицированы. Цитогенетическое обследование необходимо проводить новорожденным с врожденными пороками развития, недоношенным; больным с олигофренией, нарушением половой дифференцировки, с первичной и вторичной аменореей, спонтанными абортами, лицам с мужским бесплодием. Цитогенетический метод может применяться во многих областях практической и теоретической медицины (акушерство и гинекология, педиатрия, психиатрия, эндокринологи, патологическая анатомия и др.) - вот почему знания хромосомной патологии, ее клинических особенностей, методов диагностики и профилактики играют важную роль в подготовке будущего врача.

Как указывалось ранее, хромосомные аномалии чаще всего наблюдаются при спонтанных абортах - до 60%, у мертворожденных - до 70% и у живорожденных - около 1%.

Клинические и цитогенетические исследования, проводимые у новорожденных с хромосомной патологией, показывают, что жизнеспособность зависит от типа хромосомного нарушения. Большинство новорожденных с аутосомными трисомиями погибают в первые дни жизни. В свою очередь, у больных с аномалиями половых хромосом жизнеспособность снижена незначительно. Это зависит от того, что полная клиническая картина у данного контингента проявляется лишь в период полового созревания, когда начинают функционировать гены, определяющие половое развитие организма и формирование вторичных половых признаков.

Среди эффектов хромосомных аномалий в онтогенезе, кроме спонтанных абортов и врожденных пороков развития, у человека наблюдается явление однородительских дисомий. Однородительская дисомия возникает тогда, когда будущий потомок получает от одного из родителей обе хромосомы одной из пар (кариотип представлен 46 хромосомами). В результате может происходить гомозиготизация по патологическим рецессивным генам, которые могут быть причиной данного заболевания. Примерами однородительской дисомии являются синдромы Прадера-Вилли, Ангельмана, Беквита-Видемана и др.

Хромосомные аномалии возникают не только в ранние периоды онтогенеза. Спонтанный уровень хромосомных перестроек наблюдается у человека на протяжении всей жизни (около 2%). Чаще всего эти перестройки обычно элиминируются, но в какой-то момент могут стать источником злокачественного роста. Известно, что некоторые числовые и структурные хромосомные аномалии либо вызывают злокачественную трансформацию клеток, либо обусловливают предрасположенность к развитию онкологических заболеваний. Опухолевая прогрессия часто возникает в результате появления новых клеточных клонов, несущих различные виды хромосомных перестроек, которые кардинально отличаются от исходного клеточного штамма. В результате анализа огромного количества опухолей (свыше 25 тыс.), который был суммирован и опубликован в пятом издании «Каталога хромосомных аберраций при онкологических заболеваниях», удалось выявить новые гены, изменение которых в некоторых случаях могло привести к злокачественному перерожде-

нию нормальных клеток. По данным ВОЗ, рак это общее обозначение более чем 100 болезней, которые могут поражать любую часть организма, и его считают болезнью генома. Ретинобластома явилась первой опухолью, для которой была выявлена специфическая связь с презиготной хромосомной мутацией в длинном плече хромосомы 13. Классическим примером хромосомной мутации, детерминирующей возникновение хронического миелоидного лейкоза, является так называемая филадельфийская хромосома. Транслокация участков длинных плеч хромосом 9 и 22 приводит к образованию аномальной хромосомы, вызывающей злокачественные изменения белой крови. Известны и другие транслокации хромосом (8;21), (8;14), которые приводят к возникновению соответственно острого миелоидного лейкоза и лимфомы Беркитта.

В середине 60-х годов прошлого века многочисленными исследованиями было доказано, что у больных с врожденными хромосомными аномалиями рак возникает во много раз чаще, чем в популяции, и предрасположенность к новообразованиям при некоторых наследственных синдромах сопровождается (или обусловлена) повышенной частотой спонтанных или индуцированных хромосомных повреждений.

Необходимо помнить, что при старении организма спонтанный уровень хромосомных нарушений увеличивается.

Патологические синдромы, объединяемые термином «хромосомные болезни», являются неоднородными. Описано большое количество многообразных форм хромосомных аномалий у человека. Однако не все из них могут претендовать на «самостоятельность» в виде четко очерченного синдрома или болезни. Это связано с тем, что при некоторых хромосомных нарушениях патологическое состояние не обусловлено непосредственно конкретной хромосомной перестройкой.

Общая частота морфологических пороков развития у детей в возрасте до 1 года составляет примерно 27,2 на 1000 населения. Около 60% из них выявляются в первые 7 дней жизни уже в родовспомогательных учреждениях. Одна из частных причин пороков развития - орофасциальные расщелины, которые входят в «большую пятерку» уродств, занимая по частоте второе место.

По сведениям национального института стоматологии США, 40% населения мира имеют врожденные и наследственные аномалии развития черепно-лицевой области, из которых 15% нуждаются в серьез-

ном хирургическом лечении. По данным ВОЗ, общая встречаемость врожденной расщелины верхней губы и нёба в мире колеблется от 0,8 до 2 случаев на 1000 рождений. Распространение по континентам следующее: в Азии - 1 случай на 500 новорожденных; в Европе - 1 на 700; в Африке - 1 на 1000; в России - 1 на 800. По разным источникам, доля больных с врожденными и наследственными аномалиями черепно-лицевой области в России составляет около 35%, причем ежегодно рождается свыше 50 тыс. детей, которые требуют пристального внимания стоматологической службы.

Одним из самых частых врожденных пороков развития среди всех аномалий челюстно-лицевой области является расщелина губы и нёба, популяционная частота которой по разным источникам колеблется от 1:1000 до 1:460 (ежегодно в Москве этот показатель примерно 1:700). Расщелины губы и/или нёба составляют около 87% от всех врожденных пороков развития лица. Почти каждая пятая типичная расщелина является компонентом тяжелого синдрома.

Из 3 трисомий (синдром Дауна, синдром Патау и синдром Эдвардса), которые встречаются у человека, расщелины губы и/или нёба чаще всего возникают при синдроме Патау (около 70%) и считаются наиболее типичным признаком данного синдрома.

Анализ обращаемости в медико-генетические консультации показывает, что чаще всего к этому специализированному виду медицинской помощи обращаются семьи с хромосомными болезнями, врожденными пороками развития и нервно-психическими заболеваниями. Цитогенетический метод и молекулярно-цитогенетические методы позволяют непосредственно выявить все нарушения кариотипа. Они применяются в тех случаях, когда хромосомная аномалия предполагается как наиболее вероятный этиологический фактор патологии в семье.

Для заболеваний, обусловленных числовыми аберрациями хромосом, вероятность повторного случая в семье крайне мала (не превышает 1%), если известно, что ни у одного из родителей нет хромосомной аномалии, а также отсутствуют другие факторы риска (например, средний возраст матери). Исключение составляют транслокации.

Для семей, в которых уже имеется ребенок с трисомной формой синдрома Дауна, риск рождения еще одного больного ребенка повышен (1 на 50-200 новорожденных в отношении синдрома Дауна и 1 на 100 новорожденных в отношении всех хромосомных аномалий).

При аномалиях половых хромосом повторные случаи любой из них в семье исключительно редки. При синдромах ХХУ и ХХХ обнаружена связь с возрастом матери. В этих случаях риск для сибсов оценивается эмпирически (для каждого типа аномалии) с учетом возраста матери. Наиболее неблагоприятным будет прогноз при транслокациях в том случае, если в гаметах одного из родителей имеется сбалансированная хромосомная мутация.

Показания для проведения цитогенетического обследования:

Возраст женщины более 35 лет;

Наличие у предыдущего ребенка хромосомных аномалий;

Врожденные пороки двух и более систем;

Врожденные пороки в сочетании с олигофренией;

Олигофрения неясной этиологии;

Носительство семейной хромосомной перестройки;

Спонтанные аборты и привычное невынашивание беременности;

Патология плода, выявленная при УЗИ. Правила записи аномальных кариотипов по аутосомам:

Любому врачу, сталкивающемуся в своей практической деятельности с хромосомными аномалиями, необходимо знать правила записи нормальных и абберантных кариотипов. При этом необходимо помнить следующее.

1. В самом начале указывается общее число хромосом.

3. Добавочная аутосома обозначается соответствующим номером и знаком «+», который ставится перед хромосомой, например: 47, ХУ, +21 (мужской кариотип с синдромом Дауна). Утрата целой хромосомы обозначается знаком «-», например: 45, ХХ, -13 (женский кариотип с моносомией по 13 хромосоме).

4. Короткое плечо хромосомы, как уже отмечалось, обозначается латинской буквой «р», длинное плечо - «q». Например, 46, ХУ, 5 р- (синдром «кошачьего крика»).

5. Транслокация обозначается буквой «t» с расшифровкой в скобках, например, 45, ХХ, t (14/21) - женщина-носительница сбалансированной транслокации 14/21.

6. Присутствие более чем одной клеточной линии (мозаицизм) обозначается знаком дроби, например: 45, Х/46, ХХ - мозаик по синдрому Шерешевского-Тернера.

Этими символами и терминологией пользуются только при рутинном способе окрашивании хромосом человека. С разработкой и внедрением в цитогенетику человека новых методов окрашивания хромосом, в частности дифференциального окрашивания, появились несколько технических процедур, которые воспроизводят индивидуальную специфическую исчерченность метафазных хромосом. Хромосома стала окрашиваться в темные и светлые полосы (band) . При различных методах обработки хромосомных препаратов одни и те же полосы могут быть либо светлыми, либо темными.

В зависимости от цели исследования в клинической цитогенетике используют два принципиальных типа дифференциального окрашивания. При первом типе применяются методы, окрашивающие хромосому на всем ее протяжении (методы G-, Q-, R-полосы). При втором - целенаправленно окрашиваются специфические хромосомные структуры: конституциональный гетерохроматин (С-полосы), теломерные полосы (Т-полосы) и районы ядрышкового организатора (ЯОР).

Каждая индивидуальная хромосома в кариотипе содержит серию чередующихся полос (светлых и темных), которые располагаются по всей длине плеч хромосом в определенных районах. Нумерация полос и участков идет в направлении от центромеры к теломере каждого плеча. Участками (районами) называются сегменты хромосом, находящиеся между двумя соседними полосами. Для обозначения любой хромосомы придерживаются следующего правила - указывается:

1) номер хромосомы;

2) символ плеча (p and q);

3) номер участка (района);

4) номер полосы (или субполосы) в пределах этого участка. Вышеприведенные обозначения записываются по порядку без

пробелов и пунктуации.

Приведем примеры некоторых записей:

46, ХУ, del(5)p12) - эта запись относится к делеции короткого плеча 5 хромосомы, участку 1, полосе 2.

45, ХУ, rob(13;21)(q10;q10) - означает, что в данном случае имеется робертсоновская транслокация с утратой коротких

плеч 13 и 21 хромосомы; разрыв и воссоединение произошли в 10-м участке (район центромер) длинных плеч обеих хромосом.

Mos 45, ХО/46, ХХ(r) - в этом случае имеется мозаицизм при синдроме Шерешевского-Тернера с кольцевой Х хромосомой.

Более подробные сведения по номенклатуре и классификации хромосомных аномалий в норме и патологии приведены в авторитетных источниках Прокофьевой-Бельговской А.А. (1969), Ворсановой С.Г. (2006) и в международном документе «Международная система для номенклатуры в цитогенетике человека» (2005).

3.5. ЛЕЧЕНИЕ ХРОМОСОМНЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Лечение хромосомной патологии - в основном симптоматическое. Цель такой терапии заключается в том, чтобы скорректировать такие фенотипические проявления, как умственная отсталость, замедленный рост, недостаточная феминизация или маскулинизация, недоразвитие гонад, устранение или исправление различных костных дефектов и т.д. Для этого широко используют различные виды терапии, в том числе анаболические гормоны, андрогены и эстрогены, гормоны гипофиза и щитовидной железы, различные витамины и общеукрепляющие средства. Очень широко применяется хирургическое, симптоматическое лечение: удаление катаракты, лишнего (шестого) пальца на ноге или руке, пластические операции при незаращении верхней губы и/или нёба, устранение стеноза привратника и врожденных пороков сердца, удаление различных опухолей и т.д. Перечисленные дефекты часто сопровождают трисомии по хромосомам 13, 18 и 21, триплоидию, синдромы 4р- и 5р- и иные хромосомные аномалии. Из других видов симптоматической терапии следует отметить климатотерапию, бальнеолечение, разные виды электротерапии, теплолечение, рентгенорадиологическое облучение.

Несмотря на широкое разнообразие симптоматической терапии, применяемой для лечения хромосомных болезней, они до сих пор неизлечимы. Учитывая этот фактор, в настоящее время основное внимание уделяется предупреждению рождения детей с хромосомными аномалиями.

3.6. КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ХРОМОСОМНЫХ БОЛЕЗНЕЙ

К хромосомным болезням относят группу врожденных патологий, которые возникают в результате нарушения числа и структуры хромосом в соматических и половых клетках человека. Общая популяционная частота таких аномалий - около 1%. Как правило, это спорадические случаи; большинство хромосомных заболеваний (90%) возникает за счет новых мутаций. Исключение составляют транслокационные варианты, которые являются результатом сбалансированных транслокаций родителей.

3.6.1. Аутосомные синдромы

Переходя к общей характеристике аутосомных синдромов, следует помнить, что все моносомии по любой из аутосом обычно приводят к внутриутробной гибели плода. Чаще всего в материалах спонтанных абортусов встречаются моносомии. При трисомиях аутосом летальность гораздо меньше, однако родившиеся дети имеют тяжелейшие врожденные пороки развития. Наиболее благоприятное положение наблюдается при наличии в организме мозаицизма. Дети с мозаичным кариотипом обладают повышенной жизнеспособностью, а клиническая картина у них менее выражена. Кроме численных хромосомных нарушений, у человека описано большое количество структурных перестроек.

Известно, что среди живорожденных с аутосомными синдромами чаще всего встречаются полные трисомии по 13, 18 и 21 хромосомам, среди которых 75% приходится на долю синдрома Дауна. Из других полных трисомий по аутосомам зарегистрированы единичные случаи родов по хромосомам 8, 9, 14 и 22.

Дата добавления: 2015-09-18 | Просмотры: 1009 | Нарушение авторских прав

| 2 | | | | | | | | | | | |

Клиническая генетика. Е.Ф. Давыденкова, И.С. Либерман. Ленинград. «Медицина». 1976 год.

ВЕДУЩИЕ СПЕЦИАЛИСТЫ В ОБЛАСТИ ГЕНЕТИКИ

Амелина Светлана Сергеевна - профессор кафедры по курсу генетики и лабораторной генетики, доктор медицинских наук. Врач генетик высшей квалификационной категории

Дегтерева Елена Валентиновна - ассистент кафедры по курсу генетики и лабораторной генетики, врач-генетик первой категории

Редактор страницы: Крючкова Оксана Александровна

К цитогенетическим методам, применяемым в клинике, относятся определение полового хроматина (X- и У-хроматина) в интерфазных ядрах различных тканей, морфологических особен­ностей хроматина в нейтрофилах периферической крови (бара­банные палочки), а также исследование хромосом на стадии метафазы митоза для определения кариотипа.

Исследование полового хроматина

В 1949 г. Ваrr и Bertram описали в интерфазных ядрах компактное скопление хроматина в виде темноокрашенного тельца, получившее название полового хроматина (sex chromatin). В норме он встречается у женщин, у мужчин он отсутствует или представ­лен в незначительном количестве. У мужчин, имеющих одну Х-хромосому, она всегда активна, у женщин активной является только одна из двух Х-хромосом, вторая находится в неактивном, спирализованном состоянии. Она образует тельце полового хро­матина, которое определяется в интерфазном ядре клетки женского организма. Был разработан простой и быстрый метод определения Х-хроматина в мазках слизистой полости рта с окраской препа­ратов ацетоорсеином. Быстрота и легкость выполнения привели к широкому применению этого метода в медицинской практике.

Метод, до настоящего времени имевшийся в нашем распоряже­нии, выявлял только Х-хроматин, т. е. хроматин, образованный инактивированной Х-хромосомой. С момента опубликования иссле­дований Caspersson с соавт. (1969, 1970) появились возможности определения У-хроматина при помощи люминесцентно-микроско­пического исследования. Работами Zech (1969) было показано, что часть длинного плеча У-хромосомы флюоресцирует при окраши­вании акрихин-ипритом. Затем Pearson с сотр. (1970) обнаружили, что в интерфазном ядре клеток мужчин имеется флюоресцирующее тельце, названное ими F-тельцем, которое у мужчин с кариотипом ХУУ имеется в двойном количестве. Таким образом, появился

простой метод определения У-хроматина в буквальных соскобах, который может быть применен для клинических целей. Это очень удобно для популяционных исследований, так как полное карио- типирование является сложным и трудоемким.

Таким образом, в настоящее время необходимо дифференци­ровать X-хроматин и У-хроматин.

Исследование Х-хроматина. Х-хроматин может быть определен в различных тканях организма: в клетках кожи, слизистой оболочки рта, уретры, влагалища, в клетках крови, в клетках волосяной луковицы, в эпителиальных клетках осадка мочи, в амниотической жидкости и др. Он может быть исследован и в посмертном материале, например в клетках почечных канальцев мертворожденных детей (Н_ П. Бочков и сотр., 1966).

Наиболее распространенным является определение полового хроматина в буккальных мазках по методу Sanderson и Stewart (1961) с одномоментной фиксацией и окраской препаратов ацетоорсеином.

Соскоб берется металлическим шпателем с внутренней поверх­ности щеки, наносится равномерным слоем на предметное стекло, окрашивается одной каплей 1,5% или 2% раствора уксуснокислого ацетоорсеина. Раствор красителя готовится следующим образом: в 45 мл ледяной уксусной кислоты растворяется 1,5-2 г орсеина; раствор нагревается до появления паров, добавляется 55 мл дистиллированной воды и после охлаждения фильтруется. Затем препарат накрывается покровным стеклом, на которое произво­дится легкое надавливание через сложенную в 3-4 слоя марлю или фильтровальную бумагу для удаления лишней краски. На приготовление препарата требуется 2-3 мин. Если препараты просматриваются не сразу, то края покровного стекла покрыва­ются парафином для предупреждения от высыхания. В таком виде препараты можно сохранять в холодильнике до 2 суток.

Ацетоорсеин окрашивает Х-хроматин в темно-фиолетовый цвет, а нуклеоплазму - в бледно-розовый.

Для более контрастного окрашивания Х-хроматина или при отсутствии ацетоорсеина в нашей лаборатории с успехом приме­няется метод окраски, разработанный сотрудником нашей лабо­ратории- А. М. Захаровым. Он основан на метахроматическом окрашивании гетерохроматина красителями тиозиновой группы: метиленовый синий, азур I. Эти красители отечественного про­изводства обычно имеются в достаточном количестве в любой лаборатории.

Применяется 0,2-0,5% раствор одного из вышеуказанных красителей в дистиллированной воде. Разведение проводится из расчета 20-50 мг красителя на 10 мл Н20. Для приготовления одного препарата требуется 2-3 капли раствора. Требуется довести раствор до pH 4,3-4,7 несколькими каплями фосфатного буфера. Употребление буфера не всегда обязательно, так как при растворении краситель сам снижает значение pH до нужной ве­личины. Приготовление препаратов проводится таким же образом, как при ацетоорсеиновом методе.

В отличие от орсеинового метода окрашивание производится без одновременной фиксации кислотой, что предотвращает сморщивание части клеток, поэтому количество Х-хроматина при подсчете превышает в среднем на 5% то количество, которое получается при ацетоорсеиновом методе. При этом методе окрашивания цитоплазма клеток эпителия бесцветна, ядра приобретают бледно-фиолетовый цвет, тельце полового хроматина окрашивается более интенсивно и имеет красноватый цвет.

Для подсчета полового хроматина используются микроскопы МБИ- 3 или МБИ-6 с иммерсионными объективами. Подсчитывается не менее 100 пригодных для анализа ядер, при этом учитываются ядра с ровным контуром, гладкой оболочкой и половым хроматином, прилегающим к ядерной оболочке. Просматривается обычно несколько полей зрения в разных местах препарата.

По количеству телец Х-хроматина можно судить о количестве Х-хромосом. Число Х-хромосом всегда на единицу больше числа телец полового хроматина.

В последние годы получило распространение определение полового хроматина в клетках опухолей. Обнаруживается несоответствие между полом больного и «клеточным полом» опухоли. Выявляется также зависимость между содержанием полового хроматина и чувствительностью опухоли к гормонотерапии.

Исследование У-хроматина. Определение У-хроматина в ядрах клеток на стадии интерфазы может быть осуществлено при применении флюорохромных красителей, таких как акрихин или акрихин-иприт с последующей люминесцентной микроскопией. Таким образом могут быть идентифицированы хромосомы на стадии метафазы митоза, а, также хроматин в ядрах клеток. Акрихин-иприт окрашивает дистальные участки длинных плеч У-хромосомы в метафазе. Кроме того, маленькие округлые флюоресцирующие
тельца наблюдаются в интерфазных ядрах. Они встречаются у лиц мужского пола и могут рассматриваться как У-хроматин. При хромосомных нарушениях типа ХУУ наблюдается два тельца У-хроматина (рис 5). Большие популяционные исследования показали, что наиболее удобными для выявления У-хроматина

Рис. 5. Два флюоресцирующих тельца У-хроматина в интерфазном ядре больного с синдромом 47, XYY.
Окраска акрихин-ипритом.

являются эпителиальные клетки слизистой щеки и лимфоциты периферической крови (Pearson и сотр., 1970; I’olani и Multon, 1971; Robinson, 1971).

Сейчас усиленно изучаются особенности F-хроматина в норме и патологии, вариации в связи с возрастом, различным состоянием организма, корреляцией с размером флюоресцентной части метафазной У-хромосомы и др.

Соскоб эпителия слизистой щеки, полученный при помощи шпателя, наносится ровным слоем на покровное или предметное стекло. Высушенные мазки фиксируют в абсолютном метиловом спирте в течение 2 мин, а затем проводят через нисходящий ряд спиртов (этиловый спирт), выдерживая по 30 с в каждом, до воды. Мазок помещают в буфер Мак-Илвейна (pH 7,0) на 8 мин при 8°. Мазки окрашивают в течение 8-10 мин в 0,005% растворе акри­хин-иприта. Затем препараты споласкивают в свежей водопро­водной воде и дифференцируют в двух-трех порциях цитратно- фосфатного буфера Мак-Илвейна по 1-2 мин и заключают в смесь вода-глицерин (1: 1). Излишки среды тщательно удаляют фильтровальной бумагой и края покровного стекла заливают парафином.

Препараты анализируют под люминесцентным микроскопом (МЛ-2 или МЛ-3, лампа ДРШ 250 с фильтром ФС-2 и СС-2 и барьер­ным фильтром ЖС 18 + ЖЗС 19).

В ядрах клеток буквального эпителия У-хроматин обнаружи­вается в виде ярко светящихся телец на фоне умеренного свече­ния остального хроматина ядра. Общее количество клеток с У-хроматином колеблется от 33 до 92%. Размер одиночного тельца У-хроматина около 0,25-0,8 мкм в диаметре. Но У-хроматин может быть представлен в виде одной, двух, трех и более мелких глыбок в ядре. Интерфазный У-хроматин коррелируется с вариа­циями в размерах флюоресцирующих участков У-хромосом в метафазных пластинках.

Исследование У-хроматина люминесцентно-микроскопическим методом в комплексе с методом определения Х-хроматина дает возможность выявлять набор половых хромосом без кариотипирования. Исследование эндоцервикальных мазков с помощью флюоресцентной методики можно использовать для пренатального определения пола.