Perusteknologiat DNA-mikrosirujen valmistukseen. DNA-sirut Viitteet
) — pienoislevy, johon on levitetty tunnetun sekvenssin fragmentteja tietyssä järjestyksessä geneettistä analyysiä varten.
Kuvaus
DNA-mikrosiru on elektronisten mikropiirien (sirujen) analogisesti luotu laite, joka on suunniteltu havaitsemaan samanaikaisesti monia tiettyjä DNA-sekvenssejä. DNA-mikrosirua käytetään geenien ilmentymisen ja mutaatioiden etsimiseen biolääketieteellisessä tutkimuksessa. Mikrosiru on valmistettu lasista, silikonista tai muovista. DNA levitetään siihen käyttämällä konemikropainatusta ja kemiallista ompelemista monien järjestettävien pisteiden muodossa, joista jokainen sisältää saman määrän syntetisoituja DNA-fragmentteja, joilla on ainutlaatuinen sekvenssi. Muissa geenien hkomplementaariset DNA-fragmentit ommellaan mikroskooppisiin helmiin. Nykyaikaiset DNA-mikrosirut voivat samanaikaisesti mitata kymmenien tuhansien geenien ilmentymistä ihmisissä ja tunnistaa noin miljoona mutaatiota. Geeniekspression tutkimiseen tarkoitetun mikrosirun toimintaperiaate on seuraava. Geenin aktiivinen työ tietyssä kudoksessa ilmentyy sen matriisin (mRNA) kerääntymisessä. Kaikki mRNA:t uutetaan kudosnäytteestä ja käänteiskopioijaentsyymin avulla syntetisoidaan ns. komplementaarista DNA:ta (cDNA), joka on paljon vakaampi ja helpompi työskennellä kuin mRNA. Saatu cDNA-sarja leimataan käyttämällä fluoresoivia tai radioisotooppileimoja.
Yksittäisten cDNA:iden pitoisuus näytteessä on suoraan verrannollinen niiden mRNA-templaattien sisältöön ja siten vastaavien geenien aktiivisuustasoon. cDNA-seos asetetaan mikrosirulle, jonka jokaiseen kohtaan ommellaan DNA-fragmentit, jotka vastaavat yhden geenin koodaavaa sekvenssiä. cDNA:t löytävät "kohtansa" ja sitoutuvat (hybridisoituvat) niihin komplementaarisuuden periaatteen mukaisesti. Mitä enemmän tietyn lajin cDNA:ta on liuoksessa, sitä enemmän sitä on kiinnittynyt sen pisteeseen. Erityinen skannauslaite määrittää sitten cDNA-sisällön jokaisessa mikrosirun kohdassa, ja ohjelma korreloi sen pisteen edustaman geenin nimen kanssa. DNA-mikrosirututkimuksen tulos on pistematriisi, jonka intensiteetti on suoraan verrannollinen vastaavien geenien aktiivisuuteen.
Kuvituksia
Tekijät
- Naroditski Boris Savelievich
- Shirinsky Vladimir Pavlovich
- Nesterenko Ljudmila Nikolaevna
Lähteet
- DNA Chip Technology / Office of Science Education and Outreach: Research Technique Fact Sheets URL: http://www.genome.gov/DIR/VIP/Learning_Tools/Fact_Sheets/dna_chip.html (käytetty 12.10.2009)
- Ke Y., Stuart L., Yung C., Yan L., Hao Y. Itse kootut vesiliukoiset nukleiinihappokoetinlevyt leimattomiin RNA-hybridisaatiomäärityksiin.// Science – No. 5860 (319), 2008 – P .180-183
Nykyaikaiset pienet DNA-sirut, jotka korvaavat kokonaisia geneettisiä laboratorioita, pystyvät "arvaamaan melodian" eli tunnistamaan geenin muutamasta molekyylisävelestä. Jotta tämä olisi mahdollista, tutkijoiden täytyi risteyttää puolijohdeteknologia biokemian kanssa.
Nuori kalifornialainen yritys Affymetrix (aloi toimintansa vuonna 1993) on yksi markkinajohtajista geenitutkimuksen instrumenteissa.
Yritys on tunnettu vallankumouksellisesta yhdistelmästään puolijohdeteollisuudesta, niin sanotusti siruteollisuudesta ja biokemiallisista kokeistaan.
Affymetrixin DNA-siruja käytetään laajasti erilaisissa laboratorioissa, jotka osallistuvat geenianalyysiin ja geenitekniikkaan.
Mutta tavalliset ihmiset ovat paljon enemmän kiinnostuneita yrityksen muista tuotteista. Se on sirumainen laite, joka voi tunnistaa kymmeniä DNA:ta eri eläimistä ihmisen ruokanäytteestä.
bioMerieux FoodExpert-ID on itse asiassa eräänlainen niin kutsuttu GeneChip.
Laite tunnistaa biologisia jälkiä ruoasta 12 nisäkäslajista, 5 siipikarjalajista ja 16 kalalajista.
Siten sen avulla voit selvittää, sisältääkö ostajan epäilemä hanhipasta todellakin hanhenmaksaa eikä jotain muuta.
DNA-siru luodaan tietokoneiden kaltaisilla tekniikoilla, mutta se ei ole elektroninen, vaan biologinen esine (kuva affymetrix.com-sivustolta).
Ja esimerkiksi muslimit voivat tarkistaa, ovatko häikäilemättömät valmistajat laittaneet sianlihaa "naudanlihaleikkeihin".
Kaikki tämä toimii kuitenkin vain laboratoriolisäominaisuuksien avulla, joten yksinkertainen kuluttaja ei voi käyttää sirua "alastomassa" muodossaan polvella.
Ymmärtääksesi, miten FoodExpert-ID toimii, sinun on muistettava hieman genetiikkaa: DNA:n kaksoiskierteet, niiden muodostavat molekyylit - adeniini, guaniini, tymiini ja sytosiini, sekä se, että ne voidaan yhdistää vain pareittain, kuten avaimia. ja lukot.
DNA-siru sisältää lukemattomia ja myriadeja "puolitettuja" DNA-koodin fragmentteja.
Fragmentti sirun pinnasta, jossa on avainmolekyylejä (kuva osoitteesta affymetrix.com).
Kynnen kokoisen sirun pinta on jaettu 97 000 neliöön, joita kutsutaan "ominaisuuksiksi".
Jokainen "ominaisuus", halkaisijaltaan noin 26 mikronia, sisältää vain yhden DNA-koodin. Tarkemmin sanottuna monia, monia identtisiä molekyylejä.
Ja ne kaikki kuuluvat selvästi yhteen 33 eläimestä.
Kunkin fragmentin pituus on 17 emästä. Tämä riittää luotettavaan tunnistamiseen, aivan kuten 17 peräkkäin otettua nuottia missä tahansa riittää tunnistamaan mikä tahansa melodia olemassa olevasta tietokannasta.
Kokeilijat erottavat ruokanäytteestä kokonaisen sirpaleen rikkoutuneita DNA:n paloja. Mitä siellä ei ole? Ja mitä?
"Väärät" geneettisten koodien fragmentit pestään pois ja vastaavat kiinnitetään sirulle. Punaiset pallot ovat fluoresoivia molekyylejä (kuva osoitteesta affymetrix.com).
Lisätään fluoresoivan aineen molekyylejä molekyyleihin, jotka muodostavat geneettisen koodin. Levitetään tämä seos FoodExpert-ID-pinnalle. Tehtävää on vähän jäljellä.
Kaikki vastaavat koodinfragmentit yhdistetään "natiiviin" sekvensseihinsä "ominaisuus" tai toisessa.
Nyt siru voidaan pestä vedellä - kaikki ylimääräinen menee pois. Siru asetetaan lasersäteen alle, ja siepattua materiaalia sisältävät neliöt hehkuvat kirkkaasti. Jäljelle jää vain tarkistaa sirukortti ja selvittää, mikä DNA on tunnistettu.
Ja hehkun voimakkuuden perusteella voimme tehdä epäsuoran johtopäätöksen sian- ja naudanlihan suhteista hypoteettisessa kotletissamme.
Kuten näette, sirun käyttö on suhteellisen yksinkertaista ja mahdollistaa laboratorioiden, joissa on hyvin yksinkertainen laitesarja, suorittaa geneettisen analyysin.
Mutta kuinka nerokasta sirujen valmistus on? Luodakseen tällaisia biokemiallisia mestariteoksia automaattisesti ja massamittakaavassa Affymetrix yhdisti fotolitografian ja kombinatorisen kemian periaatteet.
Värilliset neliöt ovat "ominaisuuksia", jotka vastaavat tietyn DNA-koodin tunnistamisesta (kuva osoitteesta affymetrix.com).
Alkutuote - kvartsilevy - päällystetään erityisellä reagenssilla, silaanilla, joka yhdistyy tiukasti kvartsin kanssa ja muodostaa tiukasti jaksollisen molekyylimatriisin (tasaisella pintatiheydellä), joka on valmis hyväksymään nukleotidit.
Tulevan koodin ketjuissa pohjat menevät pystysuunnassa ylöspäin, ja ne levitetään samanaikaisesti koko pinnalle kerros kerrokselta.
Tietenkin joka kerta, kun tiettyä ainetta syötetään sirulle, ja sen varmistamiseksi, että se on kiinnitetty vain tiettyihin "ominaisuuksiin", käytetään samoja mikronineliöitä, naamioita, jotka ovat samanlaisia kuin mikropiirien tuotantoon tarvittavat.
Suurentunut kuva reagoineesta sirusta. Valkoiset, punaiset ja keltaiset neliöt ovat alueita, joissa on korkea fluoresoivan aineen pitoisuus. Vihreä, sininen, musta - vastaavasti, enemmän ja enemmän alhainen (kuva sivustolta affymetrix.com).
Joka kerta vain ne pohjat, jotka on valaistu maskin reikien läpi ultraviolettivalolla, kiinnittyvät sirun pohjaan.
Tässä peräkkäisessä synteesiprosessissa tärkeintä on levittää uusi maski joka kerta mikronin tarkkuudella, muuten kaikki levyllä olevat geneettiset koodit sekoittuvat.
Joten askel askeleelta (ruokasirussa niitä on 17, muissa yrityksen malleissa jopa 24) muodostuu pystysuorat nukleotidiketjujen sarakkeet, jotka luovat geenianalysaattorin avaimia.
Tämä tekniikka ei tietenkään palvele vain sellaisiin hauskoihin (ehkä ensi silmäyksellä) sovelluksiin kuin sianlihan tunnistamiseen hanhipastassa, vaan myös melko vakavaan tieteelliseen tutkimukseen.
Loppujen lopuksi teoriassa minkä tahansa geneettisen koodin fragmentteja voidaan levittää sirun pinnalle.
Affymetrixin työ on lisätodiste siitä, että mielenkiintoisimmat ja lupaavimmat löydöt tapahtuvat tieteiden ja tieteenalojen risteyskohdissa.
Samanlainen kuin luonnon biologinen monimuotoisuus, joka syntyy geenien sekoittumisesta. Eikö ole?
DNA-mikrosiru on yleensä pieni kiillotettu piikiekko, jonka pintaan on kiinnitetty erityisiä DNA-koettimia. Koettimet ovat vastuussa DNA:n tunnistamisesta. Koetin on pieni keinotekoisesti syntetisoitu DNA-pala, jonka tarkoituksena on tunnistaa yksi mutaatio. Eri valmistajien siruilla on useista sadaista useisiin miljooniin koettimia, ja jokainen edustaa ainutlaatuista mutaatiota.
Ennen analyysiä sirulla DNA eristetään esimerkiksi syljestä, puhdistetaan vieraista aineista ja leikataan pieniksi paloiksi.
Sitten liuos näiden fragmenttien kanssa levitetään sirulle ja jätetään hetkeksi. Tätä vaihetta kutsutaan inkubaatioksi. Tänä aikana tutkittavan DNA:n fragmentit tunkeutuvat sirulla olevien koettimien väliin, ja sitten prosessi voi kulkea kahta tietä. Yhdessä tapauksessa, jos DNA-fragmentin sekvenssi on peilikuva (komplementti) koettimen DNA-sekvenssille, tapahtuu paakkuuntumista (hybridisaatiota), koska DNA:n komplementaariset osat sopivat yhteen kuin vetoketjun reunat. Jos fragmentti on vain osittain samanlainen kuin koetin tai ei ole ollenkaan samanlainen, hybridisaatiota ei tapahdu ja se jatkaa kellumista vapaasti koettimien välillä.
Inkuboinnin jälkeen pesuvaihe alkaa poistaa sitoutumattomia fragmentteja sirusta. Tässä tapauksessa ei poisteta vain vapaita fragmentteja, vaan myös niitä, jotka ovat vain osittain hybridisoituneet. Jos hybridisaatio tapahtuu osittain, se tarkoittaa, että fragmentti ei mahtunut täysin koettimeen ja se on poistettava. Täysin komplementaariset DNA-fragmentit kiinnittyvät koettimeen niin hyvin, että ne eivät huuhtoudu pois tässä vaiheessa.
Pesun jälkeen ihmisen DNA-alueisiin liittyvät koettimet ja vapaat koettimet jäävät sirulle.
Viimeisessä vaiheessa tunnistetaan ne koettimet, joihin tutkittavan DNA:n fragmentit ovat sitoutuneet. Tässä lähestymistavat eroavat. Esimerkiksi sirulle kiinnitetään erityinen valomerkki, joka on kytketty tiukasti vain "laukaiseviin" antureisiin. Sitoutumattomat jäljet pestään uudelleen pois, ja sitten siru kuvataan mikroskoopilla. Tuloksena on ruudukko, jossa on monia monivärisiä pisteitä eri kirkkauksilla. Kun tiedät, missä kohdassa mikä koetin sijaitsee, voit ymmärtää tarkalleen, mitä DNA-sekvenssejä henkilöllä on, eli mitä mutaatioita hänellä on.
Tutkittava DNA leikataan erityisillä entsyymeillä, restriktioentsyymeillä, jotka tunnistavat erityisiä yhdistelmiä nukleotidisekvenssistä ja leikataan niiden mukaan. Nämä erityiset nukleotidien yhdistelmät ovat hajallaan melko tasaisesti koko DNA:ssa, joten fragmentit ovat pituudeltaan melko tasaisia.
Tasainen levitys sirulle saavutetaan levittämällä fragmentit liuoksen muodossa. Ja siinä lämpö (brownin) liike jakaa molekyylit tasaisesti. Jäljelle jää vain tippa liuosta siihen kohtaan sirulla, jossa anturit sijaitsevat. Ja tämä ei ole vaikeaa - yleensä tällaisen sirun ikkunan mitat ovat enintään 10x10 mm.
Vastaus
Kommentti
Viime aikoina on kehitetty aktiivisesti DNA-teknologioita, jotka mahdollistavat ominaisuuden määrittämisen lisäksi myös differentiaalisen sekvensoinnin, ts. pistemutaatioiden tai polymorfismien määrittäminen genomin tunnetuilla alueilla. Näillä tekniikoilla on merkittäviä etuja perinteisiin molekyylibiologisiin menetelmiin verrattuna, koska ne mahdollistavat testinäytteen ja analysaattorin pienentämisen, mikä vähentää merkittävästi analyysin kustannuksia ja sen aikaa, sekä määrittää samanaikaisesti testinäytteen erilaisia parametreja menettämättä vahvistusmenetelmien herkkyyttä. Merkittävin etu menetelmissä, jotka perustuvat sirujen käyttöön kaikkien mahdollisten tietynpituisten nukleotidisekvenssien oligonukleotideilla, on niiden monipuolisuus. Minkä tahansa sekvenssin oligonukleotidin läsnäolo sirulla mahdollistaa minkä tahansa tutkittavan sekvenssin analysoinnin. Mikrosirujen käyttö perustuu periaatteeseen, että tiettyjen ligandien vuorovaikutukset voidaan määrittää nopeasti useiden eri koettimien kanssa samanaikaisesti. Itse asiassa biologiset mikrosirut ovat yksi tai toinen kiinteä kantaja, jolle levitetään joko tiettyjä nukleiinihappofragmentteja tai proteiineja tai hiilihydraatteja tai mitä tahansa muita koetinmolekyylejä, jotka voidaan tunnistaa tai joilla on biologista aktiivisuutta. Erilaisten koettimien määrä substraatilla voi nousta satoihin tuhansiin, ja kunkin tyyppiset sirut ovat täysin identtisiä, ja olemassa olevien teknologioiden avulla ne voidaan kopioida sadoiksi tuhansiksi ja miljooniksi kopioiksi substraatille.
DNA-mikrosirut
Siellä on proteiini-, DNA-, hiilihydraatti- ja kudossiruja. DNA-sirut ansaitsevat erityistä huomiota. Ne edustavat ainutlaatuista analyyttistä työkalua, jonka avulla voit määrittää tiettyjen DNA-sekvenssien läsnäolon analysoidusta näytteestä (yleensä biologista alkuperää oleva) (ns. hybridisaatioanalyysi). Analyysin suorittaminen DNA-sirujen avulla on useita kertoja halvempaa kuin vaihtoehtoisten tekniikoiden (elektroforeesi, reaaliaikainen PCR) käyttö ja mahdollistaa yksinkertaisella detektorilla työskentelyn laboratorion ulkopuolella.
DNA-siruja käytettiin ensimmäisen kerran tutkimuksessa viime vuosisadan 80-luvun lopulla. Tämä nyt laajalle levinnyt menetelmä, joka mahdollistaa monien geenien ilmentymisen samanaikaisen analyysin, perustuu periaatteeseen mRNA- tai cDNA-kohteiden tunnistamisesta niiden hybridisaatiolla mikrosirulle immobilisoitujen yksijuosteisten DNA-fragmenttien kanssa.
DNA-siru on kiinteä tuki, jolle immobilisoidaan (yleensä kovalenttisesti) eripituisia yksijuosteisia DNA-fragmentteja: lyhyet - 15-25 nukleotidia, pitkät - 25-60 nukleotidia ja cDNA-fragmentit - 100-3000 nukleotidia. Substraattimateriaaleina käytetään lasia, piitä, erilaisia polymeerejä, hydrogeelejä (esimerkiksi polyakryyliamidipohjaisia) ja jopa kultaa.
Hybridisaatio on tekniikan perusta
Kaikkien nykyaikaisten DNA-tekniikoiden perusta on hybridisaatio. Hybridisaation seurauksena nukleiinihappomolekyylit pystyvät muodostamaan stabiileja kaksijuosteisia rakenteita molekyylien elementtien - nukleotidien - välisten sidosten ansiosta. Nukleotidi adeniini (A) on komplementaarinen tymiinille (T), guaniini (G) on komplementaarinen sytosiinille (C). Tämän seurauksena yksijuosteinen nukleotidisekvenssi ATGC muodostaa stabiilin assosiaation, kaksijuosteisen rakenteen, TACG-koostumuksen yksijuosteisen DNA-molekyylin kanssa.
….. ATGC….
| | | |
….. TACG….
Tällainen komplementaarisuus johtaa kahden DNA-molekyylin "kiinnittymiseen", joista toinen voidaan kiinnittää kiinteästi substraattiin ja muodostaa DNA-sirun elementin. Mitä enemmän näytteessä on molekyylejä, jotka ovat komplementaarisia sirun elementeille, sitä enemmän niitä sitoutuu siruun ja sitä suurempi on tästä elementistä havaittavan signaalin intensiteetti. Kuvassa Kuvassa 1 on esitetty DNA-solun tai oligonukleotidibiosirun toimintaperiaate, joka perustuu adeniiniemäksen komplementaarisiin vuorovaikutuksiin ( A) tymiinin kanssa ( T) ja guaniini ( G) sytosiinin kanssa ( KANSSA) kahdessa DNA-juosteessa. Jos emästen sekvenssi yhdessä DNA-juosteessa (tai oligonukleotidissa) on täysin komplementaarinen toisen juosteen sekvenssin kanssa, muodostuu vakaa täydellinen kaksijuosteinen heliksi - dupleksi. Kuitenkin esimerkiksi yhdenkin väärän parin esiintyminen duplexissa G-G, estää duplexin muodostumisen. Jos immobilisoit tietyn yksijuosteisen DNA:n tai esimerkiksi 20-meerisen oligonukleotidin (koettimen) johonkin mikrosirun elementtiin, niin kun mikrosirulle lisätään fluoresoivilla väriaineilla leimattuja DNA-fragmentteja, esimerkiksi ihmisen genomia, niiden erittäin spesifinen vuorovaikutus tapahtuu. Tietty biosirun oligonukleotidielementti sitoo spesifisesti vain yhden komplementaarisen sekvenssin 4 20 = 1,09 x 10 12 kaikista mahdollisista tämän pituisista DNA:n sekvensseistä. Tämän seurauksena fluoresoiva hehku havaitaan vain tässä biosirun täydentävässä elementissä. Siten yksi biosirun elementti tuottaa yhden näytteen noin biljoonasta mahdollisesta vaihtoehdosta, toisin kuin elektronisen sirun elementti, jossa tapahtuu binääristä näytteenottoa: JOO tai EI.
Riisi. 1. Kaavio DNA:n kaksoiskierteen muodostumisesta biosirulle. Oligonukleotidi on kiinnitetty johonkin biosirun elementtiin ja se sitoo selektiivisesti vain komplementaarisen monista fluoresoivasti leimatuista DNA-fragmenteista. Tämän seurauksena vain tämä elementti alkaa hehkua. Tämä johtuu komplementaaristen nukleotidiparien erittäin spesifisistä vuorovaikutuksista A Kanssa T Ja G Kanssa KANSSA. Ei-komplementaarisen parin läsnäolo, esim. G-G, estää vuorovaikutuksen ja jättää mikrosiruelementin pimeäksi.
Hybridisaatioparametrien määrittämiseen käytetyt laitteet mahdollistavat paitsi lopputuloksen, myös komplementaaristen ketjujen assosiaatio- ja dissosiaatiokinetiikan. Nämä tekniikat voivat tarjota suuren määrän tietoa, koska ne mahdollistavat näytteiden moniparametrianalyysin. Hybridisaation tulokset riippuvat DNA-näytteen pituudesta, leimatun kohde-DNA:n kemiallisesta koostumuksesta, lämpötilasta, jossa hybridisaatio suoritetaan, hybridisaatioseoksen koostumuksesta ja fluoresoivan leiman tyypistä. Tässä on huomioitava, että DNA-sirut käyttävät pääasiassa passiivista hybridisaatiota, ts. kohde-DNA:n vuorovaikutus immobilisoidun näytteen kanssa on todennäköisyysprosessi ja riippuu useista olosuhteista.
DNA-sirujen sovellukset
Tutkittavan organismin tilan arviointi ja kaikkien geenien tunnistaminen on yksi DNA-sirujen kehittäjien tärkeimmistä tehtävistä. Ratkaisu tähän ongelmaan voidaan toteuttaa immobilisoimalla kaikki kehon geenit biologiselle sirulle, mikä mahdollistaa kokonaisvaltaisen arvioinnin geenien ja genomin tilasta kokonaisuutena. Biogeneettiset tietokannat, jotka sisältävät kaiken tiedon (systeemistettynä) eri organismien geeneistä ja genomeista, tarjoavat tutkijoille valtavia mahdollisuuksia DNA-sirujen suunnittelussa.
Tärkeimmät syyt biosirututkimuksen laajaan käyttöön ovat korkea herkkyys, spesifisyys ja toistettavuus, toteutusmenettelyn yksinkertaisuus, mahdollisuus monien parametrien samanaikaiseen analysointiin ja suhteellisen alhaiset työkustannukset. Nämä samat syyt saavat meidät pitämään biosiruja lupaavana työkaluna kansantalouden eri osa-alueilla.
Yhteenvetona on huomattava, että mikrosirut ovat tehokas tapa tunnistaa samanaikaisesti kymmeniä tai tuhansia geenejä ja niiden rakenneanalyysiä, tunnistaa tiettyjä nukleotidisekvenssejä ja niiden rakenteessa olevia nukleotidimuunnelmia. Kuitenkin, kun geenejä on genomissa yksi tai useampi kopio, jota kliinisessä käytännössä kohtaa jatkuvasti, tarvitaan niiden alustava monistus. Tehokkain menetelmä DNA:n monistamiseen on polymeraasiketjureaktio, jonka aikana DNA-molekyylien määrä kasvaa eksponentiaalisesti useista miljooniin tai useampaan kopioon, ja tämän tyyppisen PCR:n, kuten Real Time, tärkein etu mahdollistaa jopa tutkittavan matriisin määrällinen arviointi. Tämä on tärkeää perus- ja integraalitieteiden kehittämisen ongelmien ratkaisemiseksi sekä diagnostisten menetelmien olosuhteiden optimoimiseksi.
Joten kahdella menetelmällä, joista on jo tullut perinteisiä joillakin tieteen ja soveltavan tekniikan aloilla, haittoineen on täysin ainutlaatuisia etuja.
Reaaliaikainen PCR:
· mahdollistaa alkuperäisen matriisin määrän arvioimisen;
· ei vaadi ylimääräisiä työvoimavaltaisia työvaiheita;
· elektroforeesivaiheen puuttuminen mahdollistaa kontaminaatioriskin minimoimisen ja siten väärien positiivisten tulosten määrän vähentämisen;
· matemaattisten analyysimenetelmien käyttö mahdollistaa saatujen tulosten automaattisen tulkinnan ja poistaa elektroferogrammien subjektiivisen arvioinnin ongelman;
· asettaa vähemmän tiukat vaatimukset PCR-laboratorion organisaatiolle ja tulosten automaattiselle rekisteröinnille ja tulkinnalle;
· säästää aikaa.
Biologiset mikrosirut:
· mahdollistaa näytteen ja analysaattorin pienentämisen;
· säästää aikaa ja analyysikustannuksia;
· voit määrittää samanaikaisesti useita testinäytteen parametreja;
· sillä on korkea monistusmenetelmien herkkyys, spesifisyys ja toistettavuus;
· Varmistaa työprosessin yksinkertaisuuden.
On mahdollista, että näiden menetelmien yhdistäminen muuntamalla polymeraasiketjureaktio mikrosirumuotoon mahdollistaa uuden sukupolven diagnostisen järjestelmän luomisen, jolle on tunnusomaista seuraavat ominaisuudet: korkeampi herkkyys ja ennen kaikkea määrityksen spesifisyys. nukleiinihappojen määrä, korkea tuottavuus alhaisilla analyysikustannuksilla, yleinen manipulaatioiden määrän vähentäminen kussakin analyysivaiheessa.
Nuori kalifornialainen yritys Affymetrix (aloi toimintansa vuonna 1993) on yksi markkinajohtajista geneettisen tutkimuksen laitteissa.
Yritys tunnetaan vallankumouksellisesta puolijohde-, niin sanotusti, "siru"-teollisuuden teknologian ja biokemiallisen testauksen yhdistelmästään.
Affymetrixin DNA-siruja käytetään laajasti erilaisissa laboratorioissa, jotka osallistuvat geenianalyysiin ja geenitekniikkaan.
Mutta tavalliset ihmiset ovat paljon enemmän kiinnostuneita yrityksen muista tuotteista. Tämä on mikropiiriä muistuttava laite, jonka avulla voit tunnistaa kymmeniä DNA:ta eri eläimistä ihmisruokanäytteestä.
bioMerieux FoodExpert-ID on käytännössä muunnelma ns. GeneChipistä.
Laite pystyy tunnistamaan 12 nisäkäslajin, 5 siipikarjalajin ja 16 kalalajin elintarvikkeissa olevat biojäämät.
Näin saadaan selville, sisältääkö ostajassa epäilyksiä herättävä hanhipasta todellakin hanhenmaksaa eikä jotain muuta.
DNA-siru luodaan tietokoneiden kaltaisilla tekniikoilla, mutta se ei ole sähköinen, vaan bioobjekti (kuva verkkosivulta affymetrix.com).
Ja esimerkiksi muslimit voivat tarkistaa, ovatko huolimattomat valmistajat laittaneet sianlihaa ”naudanlihakotletteihin”.
Kaikki tämä toimii kuitenkin vain lisälaboratorioominaisuuksien avulla, joten tavallinen kuluttaja ei voi käyttää sirua "alastomassa" muodossa, polvella.
Ymmärtääksesi, miten FoodExpert-ID toimii, sinun on muistettava hieman genetiikkaa: DNA:n kaksoiskierteet, niiden muodostavat molekyylit - adeniini, guaniini, tymiini ja sytosiini sekä se tosiasia, että ne voidaan yhdistää vain pareittain, kuten avaimet ja lukot.
DNA-siru sisältää lukemattomia ja myriadeja "puolitettuja" DNA-koodin fragmentteja.
Pala sirun pintaa avainmolekyyleillä (kuva affymetrix.com-sivustolta).
Sirun pinta, kynnen kokoinen, on jaettu 97 tuhanteen neliöön, joita kutsutaan "ominaisuuksiksi".
Mikä tahansa noin 26 mikronin "ominaisuus" sisältää vain yhden DNA-koodin. Tarkemmin sanottuna monia, monia samanlaisia molekyylejä.
Ja ne kaikki kuuluvat ehdottomasti yhteen 33 eläimestä.
Jokaisen kappaleen pituus on 17 pohjaa. Tämä riittää luotettavaan tunnistamiseen, aivan kuten 17 järjestyksessä otettua nuottia riittää löytämään minkä tahansa melodian olemassa olevasta tietokannasta.
Kokeilijat eristävät koko joukon rikkinäisiä DNA-paloja elintarvikestandardista. Mitä siellä ei ole? Ja mitä?
"Väärät" geneettisen koodin palaset pestään pois ja vastaavat kiinnitetään sirulle. Punertavat pallot ovat fluoresoivia molekyylejä (kuva verkkosivustolta affymetrix.com).
Lisätään fluoresoivan aineen molekyylejä molekyyleihin, jotka muodostavat geneettisen koodin. Levitetään tämä seos FoodExpert-ID-pinnalle. Tehtävää on vähän jäljellä.
Kaikki vastaavat koodinpalat yhdistetään "alkuperäisiin" sekvensseihinsä yhdessä tai toisessa "ominaisuus".
Nyt siru voidaan pestä vedellä - kaikki ylimääräinen menee pois. Siru asetetaan lasersäteen alle, ja siepattua materiaalia sisältävät neliöt loistavat kirkkaasti. Jäljelle jää vain tarkistaa sirukortti ja selvittää, mikä DNA on tunnistettu.
Ja hehkun voimakkuuden perusteella voimme tehdä epäsuoran johtopäätöksen sian- ja naudanlihan suhteista hypoteettisessa kotletissamme.
Kuten näemme, sirun käyttöönotto on suhteellisen helppoa ja mahdollistaa laboratorioiden, joissa on hyvin yleinen laitteisto, suorittaa geneettisen analyysin.
Mutta kuinka nerokasta onkaan sirun luominen. Luodakseen tällaisia biokemiallisia mestariteoksia automaattisesti ja massamittakaavassa Affymetrix yhdisti fotolitografian ja kombinatorisen kemian periaatteet.
Värilliset neliöt ovat "ominaisuuksia", jotka vastaavat yhden tai toisen DNA-koodin tunnistamisesta (kuva verkkosivustolta affymetrix.com).
Alkutuote - kvartsilevy - päällystetään erityisellä reagenssilla, silaanilla, joka yhdistyy tiukasti kvartsin kanssa ja muodostaa tiukasti jaksollisen molekyylimatriisin (tasaisella pintatiheydellä), joka on valmis hyväksymään nukleotidit.
Tulevan koodin ketjuissa pohjat menevät pystysuunnassa ylöspäin, ja ne levitetään koko pinnalle kerralla kerros kerrokselta.
Ilmeisesti joka kerta, kun sirulle syötetään tiettyä ainetta ja niin että se on kiinnitetty yksinomaan tiettyihin "ominaisuuksiin", käytetään niitä mikroneliöitä, naamioita, samanlaisia kuin mikropiirien valmistukseen tarvitaan.
Laukaus reagoineesta sirusta valtavalla teholla. Lumivalkoiset, punertavat ja keltaiset neliöt ovat alueita, joilla on korkein fluoresoivan aineen pitoisuus. Vihreä, sininen, musta - vastaavasti, yhä matalammalla (kuva verkkosivustolta affymetrix.com).
Joka kerta vain ne pohjat, jotka on valaistu maskin reikien läpi ultraviolettivalolla, kiinnittyvät sirun pohjaan.
Tässä vuorottelevassa synteesiprosessissa tärkeintä on käyttää uusinta maskia mikronin tarkkuudella joka kerta, muuten kaikki levyllä olevat geneettiset koodit sekoittuvat.
Joten askel askeleelta (ruokasirussa niitä on 17, muissa yrityksen malleissa jopa 24) muodostuu pystysuorat nukleotidiketjujen sarakkeet, jotka tekevät geenianalysaattorin avaimia.
Tämä kehitys ei tietenkään palvele vain sellaisia hauskoja (ehkä ensi silmäyksellä) toteutusalueita kuin sianlihan tunnistaminen hanhipasteesta, vaan myös täysin vakavaa tutkimusta.
Loppujen lopuksi sirun pinnalle voidaan teoreettisella tasolla soveltaa minkä tahansa geneettisen koodin paloja.
Affymetrixin työ on runsas todiste siitä, että merkittävimmät ja lupaavimmat löydöt tapahtuvat tieteiden ja tieteenalojen risteyksessä.
Samanlainen kuin luonnon runsaus, saatu geenejä sekoittamalla. Eikö ole?