"Schweizisk kniv" af den virale hær: Hemmeligheden bag omvendt transkriptase løses. Reverse transkriptase rolle i genteknologi
Revers transkriptase. (reversal eller RNA-afhængig DNA-polymerase) er et enzymkatalyserende DNA-syntese på en RNA-matrix i processen, der fik navnet " reverse transkription ". Navnet på processen afspejler det modsatte af processen transkription, udført i en anden retning: RNA-transkript syntetiseres med DNA-matrixmolekylet.
Disse enzymer blev fremhævet fra RNA-holdige vira ( retrovirus.). Omvendt transkriptase anvendes af tumorvirus til transkription af M-RNA til DNA-komplementær kredsløb. Når man studerer retrovirus, hvis gen er repræsenteret af enkeltstrenget RNA-molekyler, blev det konstateret, at ved siden af \u200b\u200bintracellulær udvikling passerer retroviruset i forbindelse med integration af dets genom i form af dobbeltstrenget DNA i værtscellens kromosome i form af værtscelle . I 1964 fremhævede Temin hypotesen om eksistensen af \u200b\u200bet virusspecifik enzym, der var i stand til at syntetisere komplementært DNA til RNA-matrixen. Bestræbelserne på at tildele et sådant enzym blev kronet med succes, og i 1970 åbnede Temin med Mizutani såvel som uafhængigt af dem Baltimore det ønskede enzym i lægemidlet af ekstracellulære vira af Raus Sarcoma-viruset. Denne RNA-afhængige DNA-polymerase blev betegnet revers transkriptase eller reverseret.
De mest detaljerede omvendt af retrovirusser af fugle blev undersøgt. Hver virion indeholder ca. 50 molekyler af dette enzym. Omvendt transkriptase består af to underenheder - A (65 kDa) og B (95 kDa) til stede i ækvimolære mængder. Omvendt transkriptase har mindst tre enzymatiske aktiviteter:
1) DNA-polymerase, der anvender som en matrix både RNA og DNA;
2) RNase H, hydrolyserende RNA i RNA-DNA-hybrid;
3) DNA-endonucleaseaktivitet.
Den første to aktivitet er nødvendig for syntesen af \u200b\u200bviralt DNA, og endonuklease er tilsyneladende vigtig for integrationen af \u200b\u200bviralt DNA i værtscellegenomet. Oprenset omvendt transkriptase syntetiserer DNA både på RNA og på DNA-matricer (figur 11).
Fig. 11. Skema af syntese af dobbeltstrenget DNA-kopier af RNA-molekyler
For at starte syntese, reversering, såvel som andre polymeraser, er der brug for et kort tostrenget område (primer). Primeren kan tjene et enkeltkædesegment af både RNA og DNA, som i reaktionsprocessen er kovalent forbundet med en ny-siddende DNA-kæde. Genteteknik anvendes som oligo (DT) primere, komplementære 3 "-polia til enderne af mRNA og et sæt" tilfældig "sammensætning og sekvens af hexanukleotider (tilfældige primere). Ofte til RNA-molekyler med en kendt primær sekvens, der ikke gør har. poly (A) ender, brug kemisk syntetiserede oligonukleotider, komplementære s "indhold
Omvendt transkriptase anvendes fortrinsvis til transkription af matrix-RNA til komplementært DNA (cDNA). Reaktionen af \u200b\u200brevers transkription udføres i specielt udvalgte betingelser ved anvendelse af stærke inhibitorer af rosaseaktivitet. Det er muligt at opnå fuld størrelse DNA-kopier af RNA-målmolekyler. Efter syntese på mRNA'et af den komplementære kæde af DNA og ødelæggelsen af \u200b\u200bRNA (sædvanligvis påføring under anvendelse af alkalibehandling) udføres syntesen af \u200b\u200bden anden kæde af DNA. I dette tilfælde anvendes evnen til revertase til at danne sig på 3 "enkeltstrengede cDNA-cDNA selvkontroller, der kan udføre primerfunktioner.
Matricen tjener den første kæde af cDNA. Denne reaktion kan katalyseres af både tilbagevendende og DNA-polymerase I E. coli. Det er vist, at kombinationen af \u200b\u200bdisse to enzymer tillader at øge udgangen af \u200b\u200bfuldfledet tostrengede molekyler af cDNA. Ved slutningen af \u200b\u200bsyntesen forbliver den første og anden kæde af cDNA'et kovalent bundet af stiletto-sløjfer, der tjente som en primer under syntesen af \u200b\u200bden anden kæde. Denne sløjfe spaltes af en endonuclease S1, der specifikt ødelægger enkeltstrengede områder af nukleinsyrer. De dannede ender er ikke altid dumme, og for at øge effektiviteten af \u200b\u200bden efterfølgende kloning, er de repareret til dumme ved anvendelse af et DNA-polymerase-DNA-polymerasefragment I E. coli. Det resulterende tokraftede cDNA kan derefter indlejres i kloningsvektorer, multiplicere i sammensætningen af \u200b\u200bhybrid DNA-molekyler og anvendelse til yderligere forskning.
Når man studerer retrovirus, hvis gen er repræsenteret af enkeltkædede RNA-molekyler, blev det konstateret, at i processen med intracellulær udvikling passerer de scenen for at integrere deres genom i form af dobbeltstrenget DNA i værtscellens kromosome. I 1964 fremhævede X. Temin hypotesen om eksistensen af \u200b\u200bet virusblegningsenzym, der var i stand til at syntetisere på et RNA-matrixkomplementært DNA. I 1970 åbnede X. Tehin og S. Mizutani, samt uafhængigt af dem D. Baltimore, et sådant enzym i lægemidlet af ekstracellulære vira af Raus Sarcoma-viruset. Denne RNA-afhængige DNA-polymerase opnåede navnet på vending (revers transkriptase).
De mest detaljerede omvendt af retrovirusser af fugle blev undersøgt. Hver virion indeholder ca. 50 molekyler af dette enzym. Omvendt transkriptase består af to underenheder - ά (65 kDa) og β (95 kDa) til stede i ækvimolær mængde. ά-sube er en N-terminal del (to tredjedele) af β-subunit.
Omvendt transkriptase har mindst tre enzymatiske aktiviteter:
· DNA-polymerase, der bruger som en matrix både RNA og DNA;
· RNase H, hydrolyserende RNA i RNA-DNA-hybriden, men ikke et- eller dobbeltstrenget RNA;
· DNA-endonuclease.
Den første to aktivitet er nødvendig for syntesen af \u200b\u200bviralt DNA, og endonuklease er tilsyneladende vigtig for integrationen af \u200b\u200bviralt DNA i værtscellegenomet. Β-underenheden af \u200b\u200breverseringen har alle tre aktiviteter, mens underenheden kun er polymerase og RNase N.
Oprenset omvendt transkriptase syntetiserer DNA både på RNA og på DNA-matricer. For at starte syntese, reversering, såvel som andre polymerasas, er der brug for et kort tostrenget område - primer. Primeren kan tjene et enkeltkædesegment af både RNA og DNA, som i reaktionsprocessen er kovalent forbundet med en ny-siddende DNA-kæde.
Omvendt transkriptase anvendes fortrinsvis til transkription af matrix-RNA til komplementært DNA (cDNA). Reaktionen af \u200b\u200brevers transkription udføres i nærværelse af stærke RNase-aktivitetsinhibitorer. Det er muligt at opnå fuld størrelse DNA-kopier af RNA-målmolekyler. Som primer med omvendt transkription af poly (A) indeholdende mRNA anvendes oligo (DT) (fig.) Og for RNA-molekyler, der ikke har 3 "-poler (A) -konkurrenter - kemisk syntetiserede oligonukleoter, komplementære 3 "- indhold studeret RNA. Derudover kan den sidste type RNA-molekyler oversættes til poly (A) -kontakt ved anvendelse af poly (A) -polymerase E. coli.
Efter syntese på mRNA'et af den komplementære kæde af DNA og ødelæggelsen af \u200b\u200bRNA (sædvanligvis påføring under anvendelse af alkalibehandling) udføres syntesen af \u200b\u200bden anden kæde af DNA. Samtidig anvendes evnen til revertase til at danne sig på 3 "enkeltkædede cDNA-cDNA selvkontroller, der kan udføre primerfunktionerne. Matricen er den første kæde af cDNA'et. Denne reaktion kan katalyseres af Både tilbagevendende og DNA-polymerase I E. coli. Kombinationen af \u200b\u200bdisse to enzymer tillader at øge udgangen af \u200b\u200bfuldfledet dobbeltstrengede cDNA-molekyler.
Ved slutningen af \u200b\u200bsyntesen forbliver den første og anden kæde af cDNA'et kovalent bundet af stiletto-sløjfer, der tjente som en primer under syntesen af \u200b\u200bden anden kæde. Denne sløjfe spaltes af en endonuclease S1, der specifikt ødelægger enkeltstrengede områder af nukleinsyrer. De dannede ender er ikke altid dumme, og for at øge effektiviteten af \u200b\u200bden efterfølgende kloning, er de repareret til dumme ved anvendelse af et DNA-polymerase-DNA-polymerasefragment I E. coli. Det resulterende tokraftede cDNA kan derefter indlejres i kloningsvektorer, multiplicere i sammensætningen af \u200b\u200bhybrid DNA-molekyler og anvendelse til yderligere forskning.
Revers transkriptase. (reversal eller RNA-afhængig DNA-polymerase) er et enzymkatalyserende DNA-syntese på en RNA-matrix i processen, der fik navnet " reverse transkription ". Navnet på processen afspejler det modsatte af processen transkription, udført i en anden retning: RNA-transkript syntetiseres med DNA-matrixmolekylet.
Disse enzymer blev fremhævet fra RNA-holdige vira ( retrovirus.). Omvendt transkriptase anvendes af tumorvirus til transkription af M-RNA til DNA-komplementær kredsløb. Når man studerer retrovirus, hvis gen er repræsenteret af enkeltstrenget RNA-molekyler, blev det konstateret, at ved siden af \u200b\u200bintracellulær udvikling passerer retroviruset i forbindelse med integration af dets genom i form af dobbeltstrenget DNA i værtscellens kromosome i form af værtscelle . I 1964 fremhævede Temin hypotesen om eksistensen af \u200b\u200bet virusspecifik enzym, der var i stand til at syntetisere komplementært DNA til RNA-matrixen. Bestræbelserne på at tildele et sådant enzym blev kronet med succes, og i 1970 åbnede Temin med Mizutani såvel som uafhængigt af dem Baltimore det ønskede enzym i lægemidlet af ekstracellulære vira af Raus Sarcoma-viruset. Denne RNA-afhængige DNA-polymerase blev betegnet revers transkriptase eller reverseret.
De mest detaljerede omvendt af retrovirusser af fugle blev undersøgt. Hver virion indeholder ca. 50 molekyler af dette enzym. Omvendt transkriptase består af to underenheder - A (65 kDa) og B (95 kDa) til stede i ækvimolære mængder. Omvendt transkriptase har mindst tre enzymatiske aktiviteter:
1) DNA-polymerase, der anvender som en matrix både RNA og DNA;
2) RNase H, hydrolyserende RNA i RNA-DNA-hybrid;
3) DNA-endonucleaseaktivitet.
Den første to aktivitet er nødvendig for syntesen af \u200b\u200bviralt DNA, og endonuklease er tilsyneladende vigtig for integrationen af \u200b\u200bviralt DNA i værtscellegenomet. Oprenset omvendt transkriptase syntetiserer DNA både på RNA og på DNA-matricer (figur 11).
Fig. 11. Skema af syntese af dobbeltstrenget DNA-kopier af RNA-molekyler
For at starte syntese, reversering, såvel som andre polymeraser, er der brug for et kort tostrenget område (primer). Primeren kan tjene et enkeltkædesegment af både RNA og DNA, som i reaktionsprocessen er kovalent forbundet med en ny-siddende DNA-kæde. Genteteknik anvendes som oligo (DT) primere, komplementære 3 "-polia til enderne af mRNA og et sæt" tilfældig "sammensætning og sekvens af hexanukleotider (tilfældige primere). Ofte til RNA-molekyler med en kendt primær sekvens, der ikke gør har. poly (A) ender, brug kemisk syntetiserede oligonukleotider, komplementære s "indhold
Omvendt transkriptase anvendes fortrinsvis til transkription af matrix-RNA til komplementært DNA (cDNA). Reaktionen af \u200b\u200brevers transkription udføres i specielt udvalgte betingelser ved anvendelse af stærke inhibitorer af rosaseaktivitet. Det er muligt at opnå fuld størrelse DNA-kopier af RNA-målmolekyler. Efter syntese på mRNA'et af den komplementære kæde af DNA og ødelæggelsen af \u200b\u200bRNA (sædvanligvis påføring under anvendelse af alkalibehandling) udføres syntesen af \u200b\u200bden anden kæde af DNA. I dette tilfælde anvendes evnen til revertase til at danne sig på 3 "enkeltstrengede cDNA-cDNA selvkontroller, der kan udføre primerfunktioner.
Matricen tjener den første kæde af cDNA. Denne reaktion kan katalyseres af både tilbagevendende og DNA-polymerase I E. coli. Det er vist, at kombinationen af \u200b\u200bdisse to enzymer tillader at øge udgangen af \u200b\u200bfuldfledet tostrengede molekyler af cDNA. Ved slutningen af \u200b\u200bsyntesen forbliver den første og anden kæde af cDNA'et kovalent bundet af stiletto-sløjfer, der tjente som en primer under syntesen af \u200b\u200bden anden kæde. Denne sløjfe spaltes af en endonuclease S1, der specifikt ødelægger enkeltstrengede områder af nukleinsyrer. De dannede ender er ikke altid dumme, og for at øge effektiviteten af \u200b\u200bden efterfølgende kloning, er de repareret til dumme ved anvendelse af et DNA-polymerase-DNA-polymerasefragment I E. coli. Det resulterende tokraftede cDNA kan derefter indlejres i kloningsvektorer, multiplicere i sammensætningen af \u200b\u200bhybrid DNA-molekyler og anvendelse til yderligere forskning.
Reversal - enzym, syntetiserende cDNA på en RNA-matrix.
Nogle viras genom tjener ikke DNA som sædvanlig, men RNA. Sådanne vira blev navngivet retrovirus (retro-omvendt). I 1970 åbnede D. Baltimore og Kh.m.Temein en mekanisme til overførsel af information fra viralt RNA til DNA, dvs. Tværtimod, hvad der foregår i cellerne i de højeste organismer. Denne proces blev kaldt revers transkription, og et enzym, der implementerer det, blev kaldt revers transkriptase eller revertase (revertase).
Revers transkriptase eller reverseret (reverse transkriptase, [lat. Transkription. - Omskrivning) - den enzym RNA-afhængige DNA-polymerase, med hvilken revers transkription udføres - DNA-syntese på RNA-matrixen; Det er kodet af genomer af nogle RNA-holdige vira og bevægelige genetiske elementer af genomet af højere organismer, et vigtigt "værktøj" til genteknologi. Omvendt transkriptase har mindst tre enzymatiske aktiviteter:
1) DNA-polymerase, der anvender som en matrix både RNA og DNA;
2) Aktiviteten af \u200b\u200bRNase H, hydrolyserende RNA i sammensætningen af \u200b\u200bRNA-DNA-hybriden, men ikke et eller to-strenget RNA og
3) DNA-endonucleaseaktivitet.
Åbnet uafhængigt af hinanden ved D. Baltimore og H. Temine i 1970 i RNA-holdige tumorbehandlede vira (Nobelprisen for 1975 sammen med R. Dulbeckko).
Så invers transkriptaser er i stand til at udføre syntesen af \u200b\u200bDNA på RNA-matrixen, polymerisering af fire deoxyribonukleosid-trifhosphat. Og ligesom DNA-polymerase, kun funktion i nærværelse af frø.
Omvendte transkriptaser anvendes i syntesen af \u200b\u200bdobbeltstrenget DNA, komplementært RNA (især mRNA) til efterfølgende kloning i plasmidvektorer, når de modtages biblioteker (klon) cDNA. Omvendte transkriptaser, som DNA-polymerase, kan anvendes til at administrere det radioaktive eller fluorescerende mærke i DNA-prober i sammensætningen af \u200b\u200bpassende mærket deoxyribonukleosid-trifhosphater.
Evnen til at syntetisere DNA på RNA-matrixen under visse betingelser blev påvist for termostabil DNA-polymerase Thermus-termophilus. Dette gør det muligt at anvende det til direkte at detektere specifikke RNA i biologiske prøver med PCR. Moderne modifikationer af denne fremgangsmåde gør det muligt i en reaktionsblanding (og rør) for at syntetisere i omvendt transkription reagerer et lille antal kopier af det amplificerede DNA-fragment på RNA-matrixen, som straks anvendes af det samme enzym som en matrix i konventionel PCR (One Tube PCR).