"Šveicarijos peilis" virusinė armija: išspręsta atvirkštinio transkriptazės paslaptis. Grįžtamoji transkriptazės vaidmuo genetinėje inžinerijoje
Grįžtamoji transkriptatika. (atvirkštinis arba RNR priklausomas DNR polimerazės) yra fermento katalizavimo DNR sintezė ant RNR matricos procese, kuris gavo pavadinimą " grįžtamoji transkripcija ". Proceso pavadinimas atspindi proceso priešingą transkripcija, Atlikta kitoje kryptimi: RNR transkriptas sintezuojamas DNR matricos molekule.
Šie fermentai buvo išryškinti iš RNR turinčių virusų ( retrovirusas). Atvirkštinio transkriptazės naudoja naviko virusai, skirti M-RNA transkripcijai į DNR papildomą grandinę. Studijuojant retrovirusus, kurių genas yra atstovaujama vienkartinėmis RNR molekulėmis, buvo nustatyta, kad intracelulinio vystymosi procese retrovirusas perduoda savo genomo integravimo etapą dvigubos DNR formu į šeimininko ląstelės chromosomą. . 1964 m. Teminas pabrėžė hipotezę apie viruso specifinį fermentą, galintį sintezuoti papildomą DNR į RNR matricą. Tokio fermento paskirstymo pastangos buvo karūnuotos sėkme, o 1970 m. Temin su Mizutani, taip pat nepriklausomai nuo jų Baltimorės atidarė norimą fermentą iš ekstraląstelinių virusų vaisto Raus Sarkomos viruso. Šis RNR priklausomas DNR polimerazės buvo pavadintas atvirkštinio transkriptazės arba pakeistos.
Buvo tiriamas išsamus paukščių retrovirusus. Kiekviename vionui yra apie 50 molekulių šio fermento. Grįžtamoji transkriptazė susideda iš dviejų subvienetų - a (65 kDa) ir b (95 kDa) yra lygaus kiekio. Atvirkštinio transkriptazės turi bent tris fermentinę veiklą:
1) DNR polimerazė, naudojant matricą ir RNR ir DNR;
2) RNASE H, hidrolizavimas RNR RNR - DNR hibride;
3) DNR endonukleazės veikla.
Pirmoji dvi veikla yra būtina virusinės DNR sintezei ir endonukleazėje, matyt, svarbu integruoti virusinę DNR integraciją į šeimininko ląstelių genomą. Išvalytas atvirkštinio transkriptazės sintezuoja DNR tiek RNR ir DNR matricų (11 pav.).
Fig. 11. RNR molekulių dvigubų DNR kopijų sintezės schema
Norėdami pradėti sintezę, atvirkštinį, taip pat kitas polimerazes, reikalingas trumpas dviem kryptis (gruntas). Gruntas gali tarnauti vieno grandinės segmentui tiek RNR ir DNR, kuris reakcijos procese yra kovalentiškai susijęs su nauja sėdynės DNR grandinėje. Genetinė inžinerija naudojama kaip Oligo (DT) gruntai, papildomi 3 "-polia į MRNR ir" Atsitiktinės "sudėties ir sekos" heksanukleotides "(atsitiktinių gruntų) rinkinys. Dažnai RNR molekulių su žinoma pirminė seka, kuri nėra žinoma pirminė seka turėti. Poli (a) galai, chemiškai sintezuoti oligonukleotidai, papildomas S "turinys
Grįžtamoji transkriptazė yra pageidautina naudojama Matrix RNR transkripimui į papildomą DNR (CDNA). Grįžtamieji transkripcijos reakcija atliekama specialiai pasirinktose sąlygose, naudojant stiprius Rosase aktyvumo inhibitorius. Galima gauti visą dydžio DNR kopijas RNR tikslinės molekulių. Po sintezės ant papildomos grandinės DNR ir RNR sunaikinimo (paprastai taikoma naudojant šarminio apdorojimo), antrosios grandinės DNR sintezė yra atliekamas. Tokiu atveju recertrazės gebėjimas naudojamas 3 "vieninteliams CDNA CDNA savikontrolės smeigėms, kurios gali atlikti grunto funkcijas.
Matrica tarnauja pirmojoje CDNR grandinėje. Šią reakciją galima katalizuoti abu grįžtamąjį ir DNR polimerazę I E. Coli. Rodoma, kad šių dviejų fermentų derinys leidžia padidinti visaverčių dupnuotų dudomų CDNA molekulių produkciją. Sintezės pabaigoje pirmoji ir antroji CDNR grandinė išlieka kovalentiškai susieta stiletto kilpos, kurios antrosios grandinės sintezės metu buvo gruntas. Ši kilpa yra suskaldyta "Endonuclease S1", konkrečiai sunaikinant vienpuses nukleino rūgščių sritis. Suformuoti galai ne visada yra kvaili, ir padidinti vėlesnio klonavimo efektyvumą, jie yra pakartojami į kvailą naudojant DNR polimerazės DNR polimerazės fragmentą I E. Coli. Gauta dviejų dalių CDNA gali būti įterpta į klonavimo vektorių, dauginti į hibridinių DNR molekulių sudėtį ir naudoti tolesniems tyrimams.
Studijuojant retrovirusus, kurių geną atstovauja vienos grandinės RNR molekulės, buvo nustatyta, kad intracelulinio vystymosi procese jie perduoda savo genomo integravimo etapą dvigubos DNR forma į šeimininko ląstelės chromosomą. 1964 m., X. Teminas pabrėžė hipotezę apie viruso balinimo fermento egzistavimą, galinčią sintezuoti ant RNR matricos papildomos DNR. 1970 m., X. Tehin ir S. Mizutani, taip pat nepriklausomai nuo jų D. Baltimorė, atidarė tokį fermentą iš ekstraląstelinių virusų vaisto Raus Sarkomos viruso. Šis RNR priklausomas DNR polimerazė gavo pakartotinio (atvirkštinio transkripto) pavadinimą.
Buvo tiriamas išsamus paukščių retrovirusus. Kiekviename vionui yra apie 50 molekulių šio fermento. Grįžtamoji transkriptazė susideda iš dviejų subvienetų - ά (65 kDa) ir β (95 kDa) yra lygaus kiekio. ά -sube yra N-galinės dalies (du trečdaliai) iš β-subvieneto.
Atvirkštinio transkriptazės turi bent tris fermentinę veiklą:
· DNR polimerazės, kuri naudoja kaip matrica tiek RNR ir DNR;
· RNASE H, hidrolizavimas RNR RNR DNR hibride, bet ne vienkartinėje arba dvigubai didėjančioje RNR;
· DNR endonukleazė.
Pirmoji dvi veikla yra būtina virusinės DNR sintezei ir endonukleazėje, matyt, svarbu integruoti virusinę DNR integraciją į šeimininko ląstelių genomą. Atšaukimo β-subvienetas turi visas tris veiklas, o subvienetas yra tik polimerazė ir RNASE N.
Išvalytas atvirkštinės transkriptazės sintezuoja DNR tiek RNR, tiek DNR matricose. Norint pradėti sintezę, atvirkštinį, taip pat ir kitus polimerasas, reikalingas trumpas dviem krypčių svetainė - gruntas. Gruntas gali tarnauti vieno grandinės segmentui tiek RNR ir DNR, kuris reakcijos procese yra kovalentiškai susijęs su nauja sėdynės DNR grandinėje.
Grįžtamoji transkriptazė yra pageidautina naudojama Matrix RNR transkripimui į papildomą DNR (CDNA). Atvirkštinio transkripcijos reakcija vykdoma esant stiprioms RNASE veiklos inhibitoriams. Galima gauti visą dydžio DNR kopijas RNR tikslinės molekulių. Kaip gruntas su atvirkštinio transkripcija policija (A) - su mRNR, oligo (DT) yra naudojamas (pav.), Ir RNR molekulių, kurių neturite 3 "-pols (A) -Concants - chemiškai sintezuoti oligonukleotes, papildo 3 "- turinys studijavo RNR. Be to, paskutinio tipo RNR molekulių galima išversti į poli (A) -Contiong naudojant poli a) -polymeraze E. coli.
Po sintezės ant papildomos grandinės DNR ir RNR sunaikinimo (paprastai taikoma naudojant šarminio apdorojimo), antrosios grandinės DNR sintezė yra atliekamas. Tuo pačiu metu, recenzė gebėjimas yra naudojamas formuoti ant 3 "vienos grandinės CDNA CDNA savikontrolės smeigtukai, kurie gali atlikti grunto funkcijas. Matrica yra pirmoji CDNA grandinė. Ši reakcija gali būti katalizuoja Abu grįžtama ir DNR polimerazė I E. coli. Šių dviejų fermentų derinys leidžia padidinti visaverčių dvigubų cdna molekulių produkciją.
Sintezės pabaigoje pirmoji ir antroji CDNR grandinė išlieka kovalentiškai susieta stiletto kilpos, kurios antrosios grandinės sintezės metu buvo gruntas. Ši kilpa yra suskaldyta "Endonuclease S1", konkrečiai sunaikinant vienpuses nukleino rūgščių sritis. Suformuoti galai ne visada yra kvaili, ir padidinti vėlesnio klonavimo efektyvumą, jie yra pakartojami į kvailą naudojant DNR polimerazės DNR polimerazės fragmentą I E. Coli. Gauta dviejų dalių CDNA gali būti įterpta į klonavimo vektorių, dauginti į hibridinių DNR molekulių sudėtį ir naudoti tolesniems tyrimams.
Grįžtamoji transkriptatika. (atvirkštinis arba RNR priklausomas DNR polimerazės) yra fermento katalizavimo DNR sintezė ant RNR matricos procese, kuris gavo pavadinimą " grįžtamoji transkripcija ". Proceso pavadinimas atspindi proceso priešingą transkripcija, Atlikta kitoje kryptimi: RNR transkriptas sintezuojamas DNR matricos molekule.
Šie fermentai buvo išryškinti iš RNR turinčių virusų ( retrovirusas). Atvirkštinio transkriptazės naudoja naviko virusai, skirti M-RNA transkripcijai į DNR papildomą grandinę. Studijuojant retrovirusus, kurių genas yra atstovaujama vienkartinėmis RNR molekulėmis, buvo nustatyta, kad intracelulinio vystymosi procese retrovirusas perduoda savo genomo integravimo etapą dvigubos DNR formu į šeimininko ląstelės chromosomą. . 1964 m. Teminas pabrėžė hipotezę apie viruso specifinį fermentą, galintį sintezuoti papildomą DNR į RNR matricą. Tokio fermento paskirstymo pastangos buvo karūnuotos sėkme, o 1970 m. Temin su Mizutani, taip pat nepriklausomai nuo jų Baltimorės atidarė norimą fermentą iš ekstraląstelinių virusų vaisto Raus Sarkomos viruso. Šis RNR priklausomas DNR polimerazės buvo pavadintas atvirkštinio transkriptazės arba pakeistos.
Buvo tiriamas išsamus paukščių retrovirusus. Kiekviename vionui yra apie 50 molekulių šio fermento. Grįžtamoji transkriptazė susideda iš dviejų subvienetų - a (65 kDa) ir b (95 kDa) yra lygaus kiekio. Atvirkštinio transkriptazės turi bent tris fermentinę veiklą:
1) DNR polimerazė, naudojant matricą ir RNR ir DNR;
2) RNASE H, hidrolizavimas RNR RNR - DNR hibride;
3) DNR endonukleazės veikla.
Pirmoji dvi veikla yra būtina virusinės DNR sintezei ir endonukleazėje, matyt, svarbu integruoti virusinę DNR integraciją į šeimininko ląstelių genomą. Išvalytas atvirkštinio transkriptazės sintezuoja DNR tiek RNR ir DNR matricų (11 pav.).
Fig. 11. RNR molekulių dvigubų DNR kopijų sintezės schema
Norėdami pradėti sintezę, atvirkštinį, taip pat kitas polimerazes, reikalingas trumpas dviem kryptis (gruntas). Gruntas gali tarnauti vieno grandinės segmentui tiek RNR ir DNR, kuris reakcijos procese yra kovalentiškai susijęs su nauja sėdynės DNR grandinėje. Genetinė inžinerija naudojama kaip Oligo (DT) gruntai, papildomi 3 "-polia į MRNR ir" Atsitiktinės "sudėties ir sekos" heksanukleotides "(atsitiktinių gruntų) rinkinys. Dažnai RNR molekulių su žinoma pirminė seka, kuri nėra žinoma pirminė seka turėti. Poli (a) galai, chemiškai sintezuoti oligonukleotidai, papildomas S "turinys
Grįžtamoji transkriptazė yra pageidautina naudojama Matrix RNR transkripimui į papildomą DNR (CDNA). Grįžtamieji transkripcijos reakcija atliekama specialiai pasirinktose sąlygose, naudojant stiprius Rosase aktyvumo inhibitorius. Galima gauti visą dydžio DNR kopijas RNR tikslinės molekulių. Po sintezės ant papildomos grandinės DNR ir RNR sunaikinimo (paprastai taikoma naudojant šarminio apdorojimo), antrosios grandinės DNR sintezė yra atliekamas. Tokiu atveju recertrazės gebėjimas naudojamas 3 "vieninteliams CDNA CDNA savikontrolės smeigėms, kurios gali atlikti grunto funkcijas.
Matrica tarnauja pirmojoje CDNR grandinėje. Šią reakciją galima katalizuoti abu grįžtamąjį ir DNR polimerazę I E. Coli. Rodoma, kad šių dviejų fermentų derinys leidžia padidinti visaverčių dupnuotų dudomų CDNA molekulių produkciją. Sintezės pabaigoje pirmoji ir antroji CDNR grandinė išlieka kovalentiškai susieta stiletto kilpos, kurios antrosios grandinės sintezės metu buvo gruntas. Ši kilpa yra suskaldyta "Endonuclease S1", konkrečiai sunaikinant vienpuses nukleino rūgščių sritis. Suformuoti galai ne visada yra kvaili, ir padidinti vėlesnio klonavimo efektyvumą, jie yra pakartojami į kvailą naudojant DNR polimerazės DNR polimerazės fragmentą I E. Coli. Gauta dviejų dalių CDNA gali būti įterpta į klonavimo vektorių, dauginti į hibridinių DNR molekulių sudėtį ir naudoti tolesniems tyrimams.
PERVERSAL - fermentas, sintezuojant CDNA ant RNR matricos.
Kai kurie virusai genomo tarnauja ne DNR kaip įprasta, bet RNR. Tokie virusai buvo pavadinta retrovirus (Retro - Reverse). 1970 m. D. Baltimorė ir kh.m.temein pradėjo perduoti informaciją iš virusinės RNR į DNR, t.y. Priešingai, kas vyksta aukščiausių organizmų ląstelėse. Šis procesas buvo vadinamas atvirkštine transkripcija, o fermentas, kuris padaro jį vadinamas atvirkštinio transkriptazės arba revertazės (pervesti).
Grįžtamoji transkriptazė arba pakeista (atvirkštinė transkriptazė, [LAT. Transkripcija. - perrašymas) - fermento RNR priklausomas DNR polimerazė, su kuria atliekamas atvirkštinis transkriptavimas - DNR sintezė RNR matricoje; Jame koduojami kai kurių RNA turinčių virusų genomais ir didesnių organizmų genų genetinių elementų, svarbios "įrankio" genų inžinerijos genetiniu elementais. Atvirkštinio transkriptazės turi bent tris fermentinę veiklą:
1) DNR polimerazė, naudojant matricą ir RNR ir DNR;
2) RNASE h, hidrolizavimo RNR aktyvumas RNR-DNR hibridinio kompozicijoje, bet ne vienai ar dviem slydriems RNR ir
3) DNR endonukleazės veikla.
D. Baltimorė ir H. Temine viena nuo kitos atidaryta 1970 m. RNR su naviko gydytų virusų (Nobelio premija už 1975 kartu su R. Dulbeckko).
Taigi, atvirkštiniai transkriptai gali atlikti DNR sintezę RNR matricoje, polimerizuojant keturis deoxyribonucleosido trifosfatą. Ir kaip ir DNR polimerazės, tik funkcija sėklų akivaizdoje.
Grįžtamieji transkriptai naudojami dvigubos DNR sintezėje, papildančioje RNR (ypač MRNR), už vėlesnį klonavimą plazmidiniais vektoriais gaunant bibliotekas (klonas) CDNA. Grįžtamieji transkriptazės, pavyzdžiui, DNR polimerazės, galima naudoti radioaktyviosios arba fluorescencinės žymės administruoti į DNR zondus tinkamai paženklintų deoxyribonukleozido trifosfatų sudėtyje.
Galimybė sintezuoti DNR ant RNR matricos tam tikromis sąlygomis buvo įrodyta termostabiliai DNR polimerazės termofilus. Tai leidžia jį naudoti tiesiogiai aptikti konkrečią RNR biologiniais mėginiais PCR. Šiuolaikiniai šio metodo pakeitimai leidžia viename reakcijos mišinyje (ir vamzdelyje), kad sintezuojami atvirkštiniame transkripte reaguoja nedidelį skaičių stiprinamo DNR fragmento kopijų RNR matricoje, kuri nedelsdami naudoja tą patį fermentą kaip matricą įprastu būdu PCR (vienas vamzdelis PCR).