"Sveitsin veitsi" viruksen armeijan: käänteisen transkriptin salaisuus ratkaistaan. Käänteinen transkripteri-rooli geenitekniikassa
Käänteinen transkripteri (peruuttaminen tai RNA-riippuvainen DNA-polymeraasi) on entsyymikatalysoi DNA-synteesi RNA-matriisissa prosessissa, joka sai nimen " käänteinen transkriptio ". Prosessin nimi heijastaa prosessin vastakohta transkriptio, suoritetaan toisessa suunnassa: RNA-transkripti syntetisoidaan DNA-matriisimolekyylin kanssa.
Nämä entsyymit korostettiin RNA: n sisältävistä viruksista ( retrovirus). Käänteinen transkriptaasi käyttää kasvainviruksia M-RNA: n transkriptiolle DNA-komplementaariseen piiriin. Tutkimuksessa retroviruksia, joiden geeniä edustaa yksijuostetut RNA-molekyylit, havaittiin, että solunsisäisen kehityksen prosessissa retrovirus kulkee sen genomin integroimiseksi kaksinkertaisen DNA: n muodossa isäntäsolun kromosomissa . Vuonna 1964 Temin korosti hypoteesia viruskohtaisen entsyymin olemassaolosta, joka kykenee syntetisoimaan komplementaarisen DNA: n RNA-matriisiin. Tällaisen entsyymin myöntämisen ponnistelut kruunattiin menestyksekkäästi, ja vuonna 1970 Temin Mizutanilla ja riippumatta heistä Baltimore avasi halutun entsyymin Raus Sarcoma -viruksen ekstrasellulaaristen virusten lääkkeeseen. Tämä RNA-riippuvainen DNA-polymeraasi nimettiin käänteisen transkriptaasiksi tai käänteisesti.
Tutkittiin kaikkein yksityiskohtaisimmat retrovirukset lintujen retroviruksista. Jokainen Virion sisältää noin 50 molekyyliä tätä entsyymiä. Käänteinen transkripteri koostuu kahdesta alayksiköstä - A (65 kDa) ja B (95 kDa), jotka ovat ekvimolaarisissa määrissä. Käänteinen transkripterillä on vähintään kolme entsymaattista toimintaa:
1) DNA-polymeraasi käyttäen matriisina sekä RNA että DNA;
2) RNaasi H, hydrolysoiva RNA RNA - DNA-hybridissä;
3) DNA endonukleaasi-aktiivisuus.
Ensimmäinen kaksi toimintaa on välttämätön viruksen DNA: n synteesiä ja endodonukleaasi, ilmeisesti on tärkeää viruksen DNA: n integroimiseksi isäntäsolugenomissa. Puhdistettu käänteisen transkriptaasi syntetisoi DNA: n sekä RNA: lla että DNA-matriiseilla (kuvio 11).
Kuva. 11. RNA-molekyylien kaksoisjuosteisten DNA-kopioiden synteesijärjestelmä
Synteesi, kääntyminen sekä muut polymerasit, tarvitaan lyhyt kaksijuttu alue (aluke). Alukkeella voi olla sekä RNA: n että DNA: n yksiketjuinen segmentti, joka reaktioprosessissa liittyy kovalenttisesti uuteen istuvaan DNA-ketjuun. Geenitekniikkaa käytetään Oligo (DT) -alukkeina, täydentävät 3 "-poliaa mRNA: n päihin ja joukko" satunnaista "koostumusta ja heksaanukleotidien (satunnaisia \u200b\u200balukkeita). Usein RNA-molekyylit, joilla on tunnetut primaariset sekvenssit, jotka eivät on. Poly (A) päättyy, käytä kemiallisesti syntetisoituja oligonukleotideja, komplementaarinen S-sisältö
Käänteinen transkriptaasi käytetään edullisesti matriisin RNA: n transkriptioon komplementaariseen DNA: han (cDNA). Käänteinen transkription reaktio suoritetaan erityisesti valituissa olosuhteissa käyttäen ruusuaktiivisuuden voimakkaita inhibiittoreita. On mahdollista saada täysikokoiset DNA-kopiot RNA-kohdemolekyyleistä. DNA: n komplementaarisen ketjun mRNA: n synteesin jälkeen ja RNA: n tuhoutuminen (yleensä käytetään alkaliprosessointia), suoritetaan DNA: n toisen ketjun synteesi. Tällöin palaasi kykyä käytetään muodostamaan 3 "yksijuostetut cDNA-cDNA itse tarkkailun nastat, jotka voivat suorittaa alukkeen toimintoja.
Matriisi palvelee ensimmäisen cDNA: n ketjua. Tätä reaktiota voidaan katalysoida sekä paluu- että DNA-polymeraasilla I E. coli. Osoitetaan, että näiden kahden entsyymien yhdistelmä mahdollistaa cDNA: n täysimittaisten molekyylien täysimittaisten molekyylien tuottamisen. Synteesin lopussa cDNA: n ensimmäinen ja toinen ketju pysyy kovalenttisesti sidottuja stiletto silmukoita, jotka toimivat alukkeen aikana toisen ketjun synteesin aikana. Tämä silmukka katkaistaan \u200b\u200bendonukleaasilla S1, joka erittelee spesifisesti nukleiinihappojen yksittäisiä alueita. Muodostuneet päät eivät aina ole tyhmää ja lisäämään seuraavan kloonauksen tehokkuutta, ne otetaan huomioon tyhmällä käyttämällä DNA-polymeraasi-DNA-polymeraasifragmenttia I E. coli. Saatu kaksijuttu cDNA voidaan sitten upottaa kloonausvektoreihin, kerrotaan hybridi-DNA-molekyylien koostumuksessa ja käyttöä lisätutkimukseen.
Kun tutkitaan retroviruksia, joiden geeniä edustaa yksiketjuisia RNA-molekyylejä, havaittiin, että solunsisäisen kehityksen prosessissa ne kulkevat sen genomin integroimiseksi kaksisäikeisen DNA: n muodossa isäntäsolun kromosomissa. Vuonna 1964 X. Temin korosti hypoteesia viruksen valkaisu-entsyymin olemassaolosta, joka kykenee syntetisoimaan RNA-matriisin komplementaariselle DNA: lle. Vuonna 1970 X. Tehin ja S. Mizutani sekä itsenäisesti D. Baltimore avasivat tällaisen entsyymin Raus SarKoman viruksen ekstrasellulaaristen virusten lääkkeeseen. Tämä RNA-riippuvainen DNA-polymeraasi sai kääntön (käänteisen transkriptaasi) nimen.
Tutkittiin kaikkein yksityiskohtaisimmat retrovirukset lintujen retroviruksista. Jokainen Virion sisältää noin 50 molekyyliä tätä entsyymiä. Käänteinen transkripteri koostuu kahdesta alayksiköstä - ά (65 kDa) ja ά (95 kDa), jotka ovat ekvimolaarisessa määrässä. ά -Sube on N-terminaalinen osa (kaksi kolmasosaa) β-alayksiköstä.
Käänteinen transkripterillä on vähintään kolme entsymaattista toimintaa:
· DNA-polymeraasi, joka käyttää matriisina sekä RNA että DNA;
· RNaasi H, hydrolysoiva RNA RNA-DNA-hybridissä, mutta ei yksi- tai kaksoisjuosteinen RNA;
· DNA endonukleaasi.
Ensimmäinen kaksi toimintaa on välttämätön viruksen DNA: n synteesiä ja endodonukleaasi, ilmeisesti on tärkeää viruksen DNA: n integroimiseksi isäntäsolugenomissa. Palautuksen β-alayksiköllä on kaikki kolme toimintaa, kun taas alayksikkö on vain polymeraasi ja RNaasi N.
Puhdistettu käänteisen transkriptaasi syntetisoi DNA: n molemmat RNA: ssa että DNA-matriiseissa. Aloittamaan synteesiä, kääntymistä sekä muita polymeerejä, tarvitaan lyhyt kaksijuttu paikka - alukkeja. Alukkeella voi olla sekä RNA: n että DNA: n yksiketjuinen segmentti, joka reaktioprosessissa liittyy kovalenttisesti uuteen istuvaan DNA-ketjuun.
Käänteinen transkriptaasi käytetään edullisesti matriisin RNA: n transkriptioon komplementaariseen DNA: han (cDNA). Käänteinen transkription reaktio suoritetaan voimakkaiden RNaasi-aktiivisuuden estäjien läsnä ollessa. On mahdollista saada täysikokoiset DNA-kopiot RNA-kohdemolekyyleistä. Alukkeena käytetään poly (a), joka sisältää mRNA: ta, käytetään oligo (DT) (kuvio) ja RNA-molekyylit, joilla ei ole 3 "-polttoainetta (A) -Concantsia - kemiallisesti syntetisoituja oligonukleotteja, komplementaarinen 3 "- Sisältö tutkittu RNA. Lisäksi viimeisimmän RNA-molekyylien tyyppiä voidaan kääntää poly (A) -Coninayiksi käyttämällä poly (a) -polymeraasia E. coli.
DNA: n komplementaarisen ketjun mRNA: n synteesin jälkeen ja RNA: n tuhoutuminen (yleensä käytetään alkaliprosessointia), suoritetaan DNA: n toisen ketjun synteesi. Samanaikaisesti palaasi kykyä muodostuu 3 "yhden ketjun cDNA-cDNA itse tarkkailun nastat, jotka voivat suorittaa alukefunktiot. Matriisi on cDNA: n ensimmäinen ketju. Tämä reaktio voidaan katalysoida Sekä paluu- että DNA-polymeraasi I E. coli. Näiden kahden entsyymien yhdistelmä mahdollistaa täysimittaisten kaksoisjuosteisten cDNA-molekyylien tuottamisen.
Synteesin lopussa cDNA: n ensimmäinen ja toinen ketju pysyy kovalenttisesti sidottuja stiletto silmukoita, jotka toimivat alukkeen aikana toisen ketjun synteesin aikana. Tämä silmukka katkaistaan \u200b\u200bendonukleaasilla S1, joka erittelee spesifisesti nukleiinihappojen yksittäisiä alueita. Muodostuneet päät eivät aina ole tyhmää ja lisäämään seuraavan kloonauksen tehokkuutta, ne otetaan huomioon tyhmällä käyttämällä DNA-polymeraasi-DNA-polymeraasifragmenttia I E. coli. Saatu kaksijuttu cDNA voidaan sitten upottaa kloonausvektoreihin, kerrotaan hybridi-DNA-molekyylien koostumuksessa ja käyttöä lisätutkimukseen.
Käänteinen transkripteri (peruuttaminen tai RNA-riippuvainen DNA-polymeraasi) on entsyymikatalysoi DNA-synteesi RNA-matriisissa prosessissa, joka sai nimen " käänteinen transkriptio ". Prosessin nimi heijastaa prosessin vastakohta transkriptio, suoritetaan toisessa suunnassa: RNA-transkripti syntetisoidaan DNA-matriisimolekyylin kanssa.
Nämä entsyymit korostettiin RNA: n sisältävistä viruksista ( retrovirus). Käänteinen transkriptaasi käyttää kasvainviruksia M-RNA: n transkriptiolle DNA-komplementaariseen piiriin. Tutkimuksessa retroviruksia, joiden geeniä edustaa yksijuostetut RNA-molekyylit, havaittiin, että solunsisäisen kehityksen prosessissa retrovirus kulkee sen genomin integroimiseksi kaksinkertaisen DNA: n muodossa isäntäsolun kromosomissa . Vuonna 1964 Temin korosti hypoteesia viruskohtaisen entsyymin olemassaolosta, joka kykenee syntetisoimaan komplementaarisen DNA: n RNA-matriisiin. Tällaisen entsyymin myöntämisen ponnistelut kruunattiin menestyksekkäästi, ja vuonna 1970 Temin Mizutanilla ja riippumatta heistä Baltimore avasi halutun entsyymin Raus Sarcoma -viruksen ekstrasellulaaristen virusten lääkkeeseen. Tämä RNA-riippuvainen DNA-polymeraasi nimettiin käänteisen transkriptaasiksi tai käänteisesti.
Tutkittiin kaikkein yksityiskohtaisimmat retrovirukset lintujen retroviruksista. Jokainen Virion sisältää noin 50 molekyyliä tätä entsyymiä. Käänteinen transkripteri koostuu kahdesta alayksiköstä - A (65 kDa) ja B (95 kDa), jotka ovat ekvimolaarisissa määrissä. Käänteinen transkripterillä on vähintään kolme entsymaattista toimintaa:
1) DNA-polymeraasi käyttäen matriisina sekä RNA että DNA;
2) RNaasi H, hydrolysoiva RNA RNA - DNA-hybridissä;
3) DNA endonukleaasi-aktiivisuus.
Ensimmäinen kaksi toimintaa on välttämätön viruksen DNA: n synteesiä ja endodonukleaasi, ilmeisesti on tärkeää viruksen DNA: n integroimiseksi isäntäsolugenomissa. Puhdistettu käänteisen transkriptaasi syntetisoi DNA: n sekä RNA: lla että DNA-matriiseilla (kuvio 11).
Kuva. 11. RNA-molekyylien kaksoisjuosteisten DNA-kopioiden synteesijärjestelmä
Synteesi, kääntyminen sekä muut polymerasit, tarvitaan lyhyt kaksijuttu alue (aluke). Alukkeella voi olla sekä RNA: n että DNA: n yksiketjuinen segmentti, joka reaktioprosessissa liittyy kovalenttisesti uuteen istuvaan DNA-ketjuun. Geenitekniikkaa käytetään Oligo (DT) -alukkeina, täydentävät 3 "-poliaa mRNA: n päihin ja joukko" satunnaista "koostumusta ja heksaanukleotidien (satunnaisia \u200b\u200balukkeita). Usein RNA-molekyylit, joilla on tunnetut primaariset sekvenssit, jotka eivät on. Poly (A) päättyy, käytä kemiallisesti syntetisoituja oligonukleotideja, komplementaarinen S-sisältö
Käänteinen transkriptaasi käytetään edullisesti matriisin RNA: n transkriptioon komplementaariseen DNA: han (cDNA). Käänteinen transkription reaktio suoritetaan erityisesti valituissa olosuhteissa käyttäen ruusuaktiivisuuden voimakkaita inhibiittoreita. On mahdollista saada täysikokoiset DNA-kopiot RNA-kohdemolekyyleistä. DNA: n komplementaarisen ketjun mRNA: n synteesin jälkeen ja RNA: n tuhoutuminen (yleensä käytetään alkaliprosessointia), suoritetaan DNA: n toisen ketjun synteesi. Tällöin palaasi kykyä käytetään muodostamaan 3 "yksijuostetut cDNA-cDNA itse tarkkailun nastat, jotka voivat suorittaa alukkeen toimintoja.
Matriisi palvelee ensimmäisen cDNA: n ketjua. Tätä reaktiota voidaan katalysoida sekä paluu- että DNA-polymeraasilla I E. coli. Osoitetaan, että näiden kahden entsyymien yhdistelmä mahdollistaa cDNA: n täysimittaisten molekyylien täysimittaisten molekyylien tuottamisen. Synteesin lopussa cDNA: n ensimmäinen ja toinen ketju pysyy kovalenttisesti sidottuja stiletto silmukoita, jotka toimivat alukkeen aikana toisen ketjun synteesin aikana. Tämä silmukka katkaistaan \u200b\u200bendonukleaasilla S1, joka erittelee spesifisesti nukleiinihappojen yksittäisiä alueita. Muodostuneet päät eivät aina ole tyhmää ja lisäämään seuraavan kloonauksen tehokkuutta, ne otetaan huomioon tyhmällä käyttämällä DNA-polymeraasi-DNA-polymeraasifragmenttia I E. coli. Saatu kaksijuttu cDNA voidaan sitten upottaa kloonausvektoreihin, kerrotaan hybridi-DNA-molekyylien koostumuksessa ja käyttöä lisätutkimukseen.
Reversal - entsyymi, cDNA: n syntetisointi RNA-matriisissa.
Jotkin viruksen genomi ei toimi tavalliseen tapaan, mutta RNA: ta. Tällaiset virukset nimettiin retrovirukseksi (retro - käänteinen). Vuonna 1970 D. Baltimore ja Kh.m.Temein avasi mekanismin tiedot viruksen RNA: sta DNA: lle, ts. Päinvastoin, mikä tapahtuu korkeimpien organismien soluissa. Tätä prosessia kutsuttiin käänteiskonstriktioksi ja entsyymi, joka toteuttaa sitä kutsutaan käänteisen transkriptaasiksi tai revertaaseiksi (revertaasi).
Käänteinen transkripteri tai käänteinen (käänteinen transkripteri, [lat. Transkriptio. - uudelleenkirjoittaminen) - entsyymi-RNA-riippuvainen DNA-polymeraasi, jolla käänteisprosessi suoritetaan - DNA-synteesi RNA-matriisissa; Se koodataan joidenkin RNA: n sisältävien virusten genomeista ja suurempien organismien genomin geneettisten elementtien, tärkeän "työkalun" geenitekniikan kannalta. Käänteinen transkripterillä on vähintään kolme entsymaattista toimintaa:
1) DNA-polymeraasi käyttäen matriisina sekä RNA että DNA;
2) RNaasi H: n, hydrolysoivan RNA: n aktiivisuus RNA-DNA-hybridin koostumuksessa, mutta ei yksi tai kaksijuostettu RNA ja
3) DNA endonukleaasi-aktiivisuus.
D. Baltimore ja H. Temine vuonna 1970 RNA: ssa sisältävien tuumorin virusten (Nobel-palkinto 1975: ssä yhdessä R. DULBECKKO).
Joten käänteiset tranrikaattimet kykenevät suorittamaan DNA: n synteesi RNA-matriisissa, polymeroimalla neljä deoksiribonukleosidin trifhofaattia. Ja aivan kuten DNA-polymeraasi, toimii vain siementen läsnä ollessa.
Käänteisiä tranrikaatioita käytetään kaksoisjuosteisen DNA: n, komplementaarisen RNA: n (erityisesti mRNA: n) synteesissä, myöhempää kloonausta varten plasmidivektoreissa, kun vastaanottaa kirjastoja (kloonia) cDNA: ta. Käänteinen tranrikaatiota, kuten DNA-polymeraasia, voidaan käyttää radioaktiivisen tai loistelamppujen antamiseen DNA-koettimiin koostumuksessa sopivasti leimattujen deoksiribonukleosidin trifhofaattien koostumuksessa.
Kyky syntetisoida DNA: n RNA-matriisissa tietyissä olosuhteissa osoitettiin termostaatiselle DNA-polymeraasin termumpophilukselle. Tämä sallii sen käyttää tiettyjä RNA: ta suoraan biologisissa näytteissä PCR: llä. Tämän lähestymistavan modernit modifikaatiot mahdollistavat yhden reaktioseoksen (ja putken) syntetisoimiseksi päinvastaisessa transkriptiossa, reagoivat pienen määrän kopioita vahvistetusta DNA-fragmentista RNA-matriisissa, joita sama entsyymi käyttää välittömästi tavanomaisina matriisina PCR (yksi putki PCR).